菌株SQR9野生型和突变体在不同IAA合成中间产物吲哚类物质中产IAA能力的探究(3)
时间:2019-05-17 19:37 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
仪器设备：高效液相色谱仪为Agilent 1260 和 Agilent G6410B，色谱柱为XDB-C18 (4.6×250 mm, Agilent)。灭菌锅、振荡培养箱、水环氏真空泵、旋转蒸发仪、冷冻干燥机、分析天平。 耗材：Millipore Millex-GP针头滤器 孔径0.22μm、一次性注射器。 1.2 方法 1.2.1 发酵液制备 将保存在-80°C甘油管的SQR9和突变体ΔysnE菌种在LB固体培养基平板划线活化，37 °C培养箱过夜培养直至长出单菌落。分别挑取SQR9和突变体ΔysnE的单菌落接种于3 ml液体LB试管中，37 °C，170 r min-1震荡培养至对数期（OD600=0.6），然后以1%接种量接种于100mL LB液体培养基的锥形瓶中培养至对数期，低速离心菌体并用无菌水洗3次后重悬菌液至OD600=0.5，发酵备用。 解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE分别以1% 接种量分别接种于浓度为0.5 mM的色氨酸（TRP）、吲哚乙醇（TOL）、 吲哚乙腈（IAN）、色胺（TAM）、吲哚丙酮酸（IPA）和吲哚乙酰胺（IAM）的200 ml Landy培养基中，22 °C，100 r min-1避光培养96h，并连续测定生长曲线(其中，色氨酸（TRP）、吲哚乙醇（TOL）、 吲哚乙腈（IAN）、色胺（TAM）、吲哚丙酮酸（IPA）和吲哚乙酰胺（IAM）过孔径0.22μm 为Millipore Millex-GP针头滤器除菌)。 1.2.2 发酵液样品处理 将上述解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE的100 ml发酵液10,000 r min-1，4 °C离心10 min，去除菌体，将上清转移至分液漏斗中，加入等体积的乙酸乙酯剧烈震荡10min，10,000 r min-1，4°C离心10 min，转移乙酸乙酯层于烧瓶中，下层萃取三次，合并乙酸乙酯于烧瓶中。37°C水浴，旋转蒸发有机相近干，用1 ml甲醇溶解，过0.22 μm滤膜，放入-20 °C冰箱保存，供HPLC定量分析。 (责任编辑：qin) |