菌株Pigmentiphagasp.H8中3,5-二溴-4-羟基苯甲酸降解关键酶基因odcA的功能验证(3)
时间:2019-05-25 20:43 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
H8 DBHB降解菌；Sper 实验室保存 H8ΔodcA 敲除odcA基因的菌株H8；Sper 本研究 H8ΔodcA (pMCS-odcA) 回补odcA基因的菌株H8ΔodcA；Sper，Kmr 本研究 质粒 pBBR1MCS-2 广宿主载体；Kmr Kovach et al., 1995[13] pJQ200SK 自杀性载体；Gmr Quandt and Hynes, 1993[14] pJQ-ΔodcA pJQ200SK中插入ΔodcA基因片段；Gmr 本研究 pMCS-odcA pBBR1MCS-2中插入odcA基因； Kmr 本研究 pET29a 表达载体；Kmr Novagen pET-odcA OdcA表达载体；Kmr 本研究 表2 本实验所用的引物及其序列 Table 2 Primer sequences used in this study 引物名称 引物序列（酶切位点） Kn1 5’-GCAGGATCCACTCAGGTAGTGATCGTTGG-3’ (BamHI) Kn2 5’-ATGCGCCACAGGTTCCCGACGCTCTTCCTGACCGCGCT-3’ Kn3 5’-GCAGCGCGGTCAGGAAGAGCGTCGGGAACCTGTGGCGC-3’ Kn4 5’-CTACTGCAGGATCATGGAACTGTCGCGCA-3’ (PstI) Mcs2-f 5’-CGAAAGCTTGCATGCGCGAACGCTATGC-3’ (HindIII) Mcs2-r 5’-CATCTAGATAGCGGCGCCTTGACGCCCCT -3’ (XbaI) odcA-f 5’-CGACATATGTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAGACCAGTGAAACCCAGGTG-3’ (NdeI) odcA-r 5’-CTAAAGCTTTTAGCGAATGGCTG-3’ (HindIII) 1.1.2 培养基与试剂 LB培养基：NaCl 5.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，去离子水1 L。 MSM培养基：NaCl 1.0 g/L ，NH4NO3 1.0 g/L，K2HPO4 1.6 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，MgSO4 0.2 g/L，去离子水1L。 TSB培养基：LB，10% 聚乙二醇，5% 二甲基亚砜，10% 甘油，10 mM MgCl，10 mM MgSO4。 TE缓冲液：10 mmol•L-1 Tris-HCl，1 mmol•L-1 EDTA。 5×KCM溶液：0.5 M KCl，0.15 M CaCl2，0.25 M MgCl2。 TEN：0.1 mol•L-1 NaCl的TE。 TER：含有100 μg•mL-1 RNA酶的TE。 结合缓冲液：100 mmol•L-1 Tris-HCl，150 mmol•L-1 NaCl，1 mmol•L-1 EDTA。 抗生素工作浓度：Amp 100 mg•L-1，Km 50 mg•L-1，Spe 80 mg•L-1，Gm 100 mg•L-1。 卡纳霉素Km、庆大霉素Gm、壮观霉素Spe等抗生素购自上海生工生物工程股份有限公司。凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司。PrimeSTAR DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶、T4 DNA连接酶等分子试剂购自大连宝生物公司（TaKaRa Biotechnology Co. Ltd）。引物合成和DNA测序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。 DBHB购自北京百灵威科技有限公司（纯度>98%）。溶菌酶、蛋白酶K、RNA酶、DTT、PMSF等分子生物学试剂购自上海生工生物工程股份有限公司和大连宝生物公司(TaKaRa Biotechnology Co. Ltd)。常规化学试剂均为分析纯，分析试剂（甲醇、乙腈等）为色谱纯，购自江苏汉邦科技有限公司和北京鼎国生物技术有限公司。 1.2 方法 1.2.1 大肠杆菌一步法感受态的制备和转化 制备：采用1989年Chung等报道的一步法制备感受态细胞[15]。将E. coli DH5α和E. coli DH5α λpir通过划线的方法在LB固体培养基上进行活化后，挑取单菌落接种至3 mL的LB液体培养基中，继续37°C培养，培养12 h后，取0.5 mL培养物接种至50 mL的LB液体培养基中。按37°C，220 rpm培养约2-3 h至其OD600=0.4。将其转移至离心管中离心，倒去上清液，取2.5 mL经冰水预冷的TBS溶液进行重悬，冰浴10 min中后装入离心管中，按每60 μL一管，于-70°C保存备用。 (责任编辑：qin) |