抗第二线粒体凋亡蛋白SmacDiablo单克隆抗体的筛选(2)
时间:2019-08-02 22:08 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
Smac/Diablo 蛋白在细胞中的表达与癌症的发展成反比关系， 即 Smac/Diablo在细胞中有促凋亡作用，可促进增生性瘢痕成纤文细胞和各种癌细胞的凋亡[7]，对于增生性瘢痕所导致的皮肤伤口的愈合和肿瘤的治疗提供了可观的前景。因此，对Smac/Diablo 蛋白的检测就是很至关重要的一步。本实验对抗 Smac/Diablo 单克隆抗体进行了筛选，以获得效价最好的抗Diablo 单克隆抗体，并进行该抗体的鉴定，检测该株抗体的灵敏度，证明抗体与蛋白 Smac/Diablo 结合效果最好，就可以大量生产，根据单抗鉴定数据，用于后续药物的研发。1 材料与方法1.1材料1.1.1 抗原与抗体Smac/Diablo抗原蛋白浓度为0.625mg/mL， CellLysate， 实验所用细胞为Hela、293T、MCF-7、Jurkat、A431，抗 Smac/Diablo 兔单克隆抗体由北京义翘神州生物技术有限公司生产提供，山羊抗兔IgGFc向 JacksonResearch 公司购入。 1.1.2 溶液的配制1) 丙烯酰胺母液：30%丙烯酰胺-0.8%甲叉丙烯酰胺配制方法：90g 丙烯酰胺＋2.4gN，N’－甲叉双丙烯酰胺，先用去离子水溶解，搅拌直到溶液变成透明，再用去超纯水稀释至300mL，棕色瓶 4℃保存。2) 4×分离胶缓冲液：4×Tris-Cl/SDS，pH8.8配制方法：在 400mL 超纯水中溶解 91gTris 碱，用 HCl调至 pH8.8，定容到500mL，加入2gSDS[0.4%(w/v)]溶解，于 4℃保存。3) 4×浓缩胶缓冲液：4×Tris-Cl/SDS，pH6.8配制方法：在 80mL 超纯水中溶解6.05gTris 碱，用 HCl 调至 pH6.8，定容至100mL，加入0.4gSDS[0.4%(w/v)]，于 4℃保存。4) 转移缓冲液：称取14.4g 甘氨酸和 3.03gTris-base，加适量超纯水溶解。5) 封闭液、抗体稀释液（5%BSA-TBS-T) ：5%BSA溶于 TBS-T 中6) DAB 贮存液：将0.5gDAB 加入 40mL1×PBS缓冲液，充分混匀保存。7) 底物溶液：1.5mLDAB(1tablet)，28.5mL1×PBS（pH7.5) ，300μL30%H2O2（现用现配) 。8) 酶标二抗山羊抗兔 IgGFc 储存液：将山羊抗兔IgGFc加入到等量的无菌水，使其终浓度为0.4mg/mL。1.1.3 酶及常用试剂甲醇，氯化镁溶液(1mol/L)，浓盐酸，RIPA细胞裂解液，蛋白酶抑制剂。 (责任编辑：qin) |