木霉T-Aloe β-1,3-葡聚糖酶的功能分析(2)
时间:2019-09-03 12:50 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
木霉T-Aloe为本实验室分离保存。 1.5 mol/L Tris-HCL（pH 8.8）、1.0 mol/L Tris-HCL（pH 6.8）、10 % SDS、30 % Acr-Bis储备液、TEMED工作液、10% APS（过硫酸铵）、IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）、甘氨酸、甘油、溴酚蓝、β-巯基乙醇、R-250考马斯亮蓝、冰醋酸、异丙醇、乙醇、蛋白Marker、葡聚糖、DNS溶液、乙酸缓冲液等。 1.1.2 实验设备 蛋白电泳仪、可见光分光光度计、电子天平、磁力搅拌器、恒温培养箱、恒温水浴锅、水平摇床、恒温摇床、pH计、电磁炉、离心机、研钵、灭菌锅等。 1.2 实验方法 1.2.1 木霉菌株的活化 对-80℃斜面保存的木霉菌接种到PDA平板上，28℃ 48h 暗培养至长满菌丝或孢子。将活化后的菌丝接种到PD液体培养基上，28℃、180rpm培养24-48h至长出菌丝，之后再接入新的培养基中活化2-3次[8]。 1.2.2 β-1,3-葡聚糖酶的诱导 通过查阅资料并不断尝试加入不同诱导剂，包括病原菌核盘菌、YK-2菌丝，0.1M TPTG，0.1M乳糖，0.1M葡聚糖分别将进行诱导，28℃、180 rpm培养72h，取出后菌丝研磨得到粗酶液备用[9-10]。 1.2.3 酶活性测定 参考β-葡聚糖酶活测定的方法[11]，以葡聚糖为作用底物，对诱导后的产物进行处理并检测其酶活性。 i 原理 β-葡聚糖酶水解1,3(4)-β-D-葡聚糖苷键，放出还原糖基团与3,5-二硝基水杨酸（DNS试剂）发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖的含量成正比关系，在540nm处测其光的吸收值，查葡萄糖标准曲线，从而得到还原糖的量，据此计算出 β-葡聚糖酶的活力单位数[12]。 ii 试剂和溶液配制 a. 0.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH5.0） 溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液； 溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液； 使用时以A：B = 3：7的比例混合，低温冷藏备用。 b. 1%的β-葡聚糖溶液的配制 准确称取0.25g β-葡聚糖放入100ml锥形瓶中，加2ml无水乙醇摇匀到无可见颗粒。加20ml无离子水混合15分钟，盖紧塞子沸水浴5分钟，放置室温自然冷却，或用自来水流动降温。将已冷却到室温的底物溶液倒入25ml容量瓶中，加入2.5ml 0.1M醋酸缓冲液（pH5.0），并用无离子水定容到25ml[13]。 c. 3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液 溶液A：称分析纯的NaOH 104g溶于1300ml水中，加入30g分析纯3,5－二硝基水杨酸； 溶液B：称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液； 将A、B溶液混合，加入1200ml水，定容5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用。 d. 标准葡萄糖溶液的配制无水葡萄糖80℃烘干至恒重，准确称取100mg溶于100ml水中，加1mg叠氮化钠防腐。4℃冷藏备用。 (责任编辑：qin) |