蛋白质亚细胞定位方法的比较(2)
时间:2019-09-17 12:46 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
近几年来研究蛋白质亚细胞定位的方法越来越成熟，技术也不断提升。①免疫组织化学定位法是通过使用已知特异性的蛋白质对组织细胞中的目标蛋白质进行检测位置，是一种把免疫反应的特异性与组织化学的可见性有效地结合起来的亚细胞定位方法，可在细胞、亚细胞水平进行检测，免疫组织化学定位法可以直接准确的反应活体状态下目标蛋白在细胞中的位置。该方法实验周期长，技术依赖性强，效率低。②免疫胶体金标记技术是根据胶体金在碱性环境中带负电的性质，使其与抗体相吸引，从而对抗体进行了标记。当使用胶体金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平下会出现明亮的樱红色，不需要再外加染色。而在电镜下，由于金颗粒的电子密度很高，易于辨认。免疫胶体金标记技术现已普遍应用于研究细胞以及组织内的蛋白定位。③免疫印迹是指将样品转移到固相载体上，然后再根据对应的探测反应对样品进行检测的一种方法，可进行目的蛋白的表达特性与表达量的分析及其组织定位[3]。 除了以上几种方法还有常用的免疫荧光和基于荧光蛋白的亚细胞定位两种方法。免疫荧光对蛋白质进行定位是最简单也是最可靠的方法，而且对于蛋白质的定位有一个较准确的判断；荧光蛋白融合基因常被用来检测两种蛋白共定位的情况。本研究将对这两种方法的一些实验条件进行摸索分析，合理调整实验方案，提高实验的效率与准确性。 1.实验仪器、材料及试剂 1.1实验仪器 表1 实验仪器信息表 仪器名称 生产厂家 型号 荧光显微镜 北京锐驰恒业仪器科技有限公司 Nikon 80i 激光扫描共聚焦显微镜 北京锐驰恒业仪器科技有限公司 Alsi+ 恒温培养箱 黄石恒丰医疗器械有限公司 SKB-02.600 微量高速离心机 Thermo Fisher Scientific LEGEND MICRO 17 旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 QL-901 生物安全柜 上海瑞仰净化装备有限公司 BSC1800-II-A/B3 冰箱 合肥美菱股份有限公司 BCD-518WEC CO2培养箱 Thermo Fisher Scientific 3111 1.2实验材料 实验所用的细胞为贴壁生长的人宫颈癌Hela细胞。Hela细胞来自人类子宫颈癌细胞，是由一种人类乳突状瘤病毒转型而成的癌细胞；由于Hela细胞分裂时可以文持端粒酶的活性从而能文持端粒的长度，以至于它不会因衰老而致死[5]。与其它癌细胞相比，Hela细胞增殖非常迅速，只要有合适的温度和足够的营养，它就可以不断地分裂增殖。因此，Hela细胞具有易于培养，增殖迅速，而且可以无限分裂的特点。Hela细胞是实验室使用最多的细胞，很多实验都可以用它来完成，达到预期结果，所得实验结果更容易被认可。 1.3试剂 PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4)、无水乙醇、多聚甲醛、丙酮、Triton-X100、山羊血清、一抗、荧光标记的二抗、DAPI染料(封片型)、转染试剂TF1、1640等。 1.4主要试剂的配制 1.4.1免疫荧光 4%多聚甲醛：称取4g多聚甲醛，加PBS定容至100ml。 0.3% Triton X100：用移液器吸取90ug Triton X100，溶解于30ml磷酸盐缓冲液中，常温保存；时间过长或者强度过高的透化有可能会破坏细胞的膜结构。 封闭液：用移液器吸取1ml的山羊血清原液(选用中杉金桥)，溶解于9ml的PBS中，4℃保存(一般现配现用)。 一抗：根据抗体浓度稀释到浓度为15ug/ml，终体积为200ug，使用旋涡混合器混匀；实验中所用抗体由北京义翘神州生物公司提供。 (责任编辑：qin) |