中华按蚊DNA克隆的荧光原位杂交(2)
时间:2019-12-08 19:25 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
按蚊体细胞染色体共有三对。它的形成是由于某些细胞内,DNA多次复制但细胞未进行细胞分裂,复制过程中形成的大量子染色体紧密排列,并阻止了染色质的进一步包装,最终在细胞内形成了具有明暗相间条带的多线染色体。在按蚊的肠,唾液腺,马氏管和卵巢营养细胞中均有多线染色体的分布。X染色体、Y染色体以及两对常染色体。由于其本身的异染色质性质,按蚊的Y染色体无法形成多线染色体。将常染色体以其着丝粒为界进行划分,按蚊的多线染色体便被划分成了五条染色体臂:X、2L、2R、3L和3R[4]。我国对于按蚊基因组测序开始于20世纪80年代叶炳辉[4]等对于中华按蚊唾液染色体的研究。他对国外常用的模式图绘图方法进行了改进,因为模式图虽然较为清楚但是与实物相差较远,应用时容易产生不便,所以他利用普通油镜和相差油镜的拍摄图为基础,随后与标本相对照,尽量按着实际形态进行绘制。,随后缪建吾[5]的研究表明雷氏按蚊嗜人亚 种 与我国中华按蚊在常染色体方面有着很大的不同。后又有石焕焕等[6]对我国云南微小按蚊(An. minimus)的染色体进行了详细的研究,发现云南微小按蚊与广西微小按蚊有相似之处,多色染色体通常为5臂组成。宋锋林等利用利用探针标记、分子杂交 、序列分析等方法成功构建淡色库蚊的基因组文库,获取了8条微卫星序列, 为淡色库蚊基因定位 、种群遗传学、种群生态学等领域的研究提供新的分子遗传标记[7]。在国外方面最先由Coluzzi和Sabatini绘制了冈比亚按蚊复合体(Anopheles gambiae complex)的唾液腺多线染色体图谱,与此同时它也是目前基因组组装最完整的一个蚊种。随后也有很多相关研究,Zheng等用46个、57个和28个微卫星DNA作为遗传标志,构建了第一幅冈比亚按蚊的X染色体、2号染色体和3号染色体的低分辨率连锁遗传图谱,其对应的染色体长度分别为48.9cM, 72.4cM和93.7cM,分辨率分别为1.1cM ,1.2cM和3.2cM,平均分辨率为1.2cM。使得狄氏剂抗性、粉眼、白眼和红眼等多个基因位点得到确认,为冈比亚按蚊基因组的研究奠定了基础[8]。Cornel等将17个基因定位到了淡色按蚊(An. albimanus)的染色体上,构建了淡色按蚊的物理图谱[9] 并且研究了按蚊染色体臂的共线性关系。在按蚊中,缺少相应的物理图谱的库蚊属(Culex)和伊蚊属(Aedes)的蚊虫全基因组研究进展相对而言比较缓慢。库蚊属的致倦库蚊(Cx. pipiens quinquefasciatus)已知全基因组序列中只有38%定位到了染色体上[10]。在伊蚊属埃及伊蚊(Aedes agypti)基因组测序完成后,其基因组序列也仅有约31%被定位到了染色体上[11]。直到2013年,大约只有183 Mbp的序列被定位到埃及伊蚊的中期染色体上[12]。除了为基因组组装提供帮助外,2000年Ranson等在冈比亚按蚊上发现了一个与DDT抗药性相关的数量性状基因座,这与冈比亚按蚊染色体图谱和物理图谱的发表也有很大的关系[13]。但是由于按蚊基因组中多处重复序列,按蚊的基因组研究充满了挑战,Holt等人建立了比较完整的按蚊物理图谱[14],随后Sharakhova等利用cDNA克隆原位杂交弥补了一些亚着丝粒区域的空白[15]。 荧光原位杂交技术所具有的快速、灵敏度高、检测信号强的特点,使它能为物理图谱的构建提供技术支持。荧光原位杂交(FISH)是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术[16]。最早在1969年gall等人利用放射性同位素标记的DNA探针,用来检测非洲爪蟾的rDNA并且取得了成功,,随后Pardue等利用RNA探针与染色体进行原位杂交,进而建立了RNA-DNA同位素原位杂交系统[17]。然而放射性同位素使用相当不便,并且制作的探针使用十分不稳定且对身体有危害,不能被广泛应用,所以荧光原位杂交发展迅速,其基本原理是一个带有特定序列的DNA或RNA作为探针,并且它可以作为DNA序列中某一段的补充物,按照碱基互补的原则,与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合,形成可被检测的杂交双链核酸[18]。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列,因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因定位在染色体上。与放射性杂交技术相比拥有几处优点:1、用荧光试剂标记探针经济、安全,同时在特异性、速度、探针稳定性方面具有明显的优势。2、多色FISH可以在同一核中显示不同颜色,从而可检测多种序列。3、应用不同的探针可以显示某一物种全部基因、某一染色体或染色体片段。4、能通过几次免疫化学反应,杂交信号增强显著,从而提高灵敏度。5、杂交信号定位更加准确,分辨率可达3~20Mb[19]。 (责任编辑:qin) |