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1.2病毒诱导的基因互补技术（VIGC）

植物病毒技术包括病毒诱导的基因互补（VIGC,Virus-induced gene complementation)和病毒诱导的基因沉默（VIGS,Virus-induced gene silence）。VIGC，即利用马铃薯X病毒（PVX）诱导内源基因在番茄突变体中超表达，从而回复番茄果实不成熟的表型。这种“功能获得性”的植物病毒技术尽管其转化存在不稳定，但它能快速揭示果实成熟过程中关键转录因子间的调控网络，在植物中代表一种可行的基因功能分析策略。因此该技术可作为探究植物基因功能的一种新颖而便捷的手段[2]。

1.3 研究背景

在番茄果实成熟期集中，采后商品处理技术和储运设施建设不足，导致果实腐烂以及品质劣变，番茄的商品性降低的背景下，除了综合配套栽培、运输、保鲜技术集成的突破，加强优异种质资源的发掘、提高综合性状、选育优良的栽培品种是番茄产业健康快速发展的关键，而加深对番茄分子遗传机制的探索则有助于通过分子遗传育种途径培育高产优质多抗专用番茄新品种。

番茄成熟是涉及果实表观形态、生理和生化变化的复杂遗传性状，决定这种复杂性状的分子遗传基础已初见端倪。早期研究主要关注于果实成熟中乙烯合成和乙烯受体介导的信号转导基因调节[1,3]，同时有关果实中的主要色素合成途径及提供果实特异风的遗传调控机理已被相继阐明[4,5]，而且发现调控细胞壁的修饰酶的表达状况与果实质地变化有关[6,7]。近年来，相关的研究表明microRNA（miRNA）也参与调控番茄果实的成熟过程[8]。英国东安格利亚大学的Dalmay教授在番茄中通过RNA深度测序检测到20个保守家族miRNA和另外10个新miRNA家族，但是这些miRNA在番茄果实发育成熟过程中的生物学功能尚不明确[9,10]。2008年，Moxon等利用5’-RACE在番茄中克隆到拟南芥At-miR156同源基因SlymiR156，并指出LeSPL-CNR mRNA 3’-UTR含有miRNA高度互补的序列[11]。将该miRNA转到番茄果实中进行过量表达，结果表明植株中番茄FT同源基因SFT mRNA 和LeSPL mRNA被降解，番茄开花延迟，果实产量和数量下降，但并不影响果实成熟，表明该miRNA在番茄生长发育过程中起作用[12]。最近，德国Max Planck研究所的Huijser教授通过生物信息学技术预测分析指出，在所有的15个番茄SPL基因中，10个SPL  mRNA（包括LeSPL-CNR）含有潜在的SlymiR156/7的响应元件[12]。然而到目前为止，很少有研究将番茄果实成熟发育的调控与这些内源miRNA种类和/或含量的变化相联系。前期研究中，qRT-PCR技术分析表明，SlymiR156在番茄中表达与果实发育成熟阶段有关，其表达量随着果实的成熟不断下降。但令人不解的是，在番茄果实成熟发育过程中，SlymiR156表达与其潜在靶基因LeSPL-CNR mRNA转录水平并不呈现负相关[11, 13]。显然，SlymiR156在番茄果实成熟中起重要调控作用，但是该作用不能简单地归结为对成熟关键转录因子LeSPL-CNR基因表达的上调或者抑制作用。因此，SlymiR156在番茄果实成熟，尤其是果实后熟进程中的具体功能，尚需进一步研究。

1.4 研究意义

    利用分子生物学及病毒介导的反向遗传技术探究Le-miR156在番茄果实成熟过程中体现的生物学功能，通过调节调控果实成熟的因子改变果实的成熟时间，以解决果实成熟时间过于集中的难题，对果实产业有着深远的意义。本课题利用马铃薯X病毒PVX介导的超表达技术，初步探究SlymiR156是否参与调控番茄果实成熟后进程，以深入了解SlymiR156在番茄果实成熟发育中的生物学功能，以期为番茄果实贮藏提供一定的参考依据。

1.5 研究内容

1）番茄SlmiR156基因克隆：提取番茄RNA，设计特异性引物，采用RT-PCR技术克 (责任编辑：qin)