拟南芥NaKR2超表达转基因株系的构建(3)
时间:2020-03-31 21:06 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
nakr1是发芽后维持根分生组织所必需的 在以往的研究中nakr1-1发芽后立马显示出明显的根系生长表型，涉及短根与侧根生长增加。当在正常的板上生长一周nakr1-1幼苗的初生根长度是野生型根的50%。用碘化丙啶对根进行染色在共聚焦显微镜下分析后确定nakr1-1的根分生组织区大小在发芽后7天急剧下降。相比之下，在野生型幼苗中分生组织大小保持更稳定，并且分生组织细胞数量的减少并不发生在野生型拟南芥中直到萌发后3到4周。nakr1-1幼苗的伸长区在发芽后7天后通常被减少到三个细胞的长度完全伸长的皮层细胞的长度也被测量。nakr1-1比野生型有更小的细胞长度。因此，nakr1-1的短根是根中细胞少和细胞小的结果。 为了确定根分生组织缺陷是否是起源于胚胎发育异常，对nakr1-1和 Col-0发育中的幼苗的不同阶段的胚胎进行了解剖。在野生型和nakr1-1的早期胚胎发育阶段两者之间无明显差异。这一结果得到了nakr1-1种子能在对板和土壤中正常发芽这一发现的支持，以及由GUS染色结果显示NaKR1只有发芽后才表达。使用静态中心标记研究幼苗根部分生组织缺陷，根小柱细胞中淀粉的积累，在根尖分生组织中细胞周期蛋白-GUS的表达。在发芽后7天后与Col-0相比nakr1-1幼苗显示更低的静态中心标记JYB1234表达。在发芽后三天nakr1-1幼苗表现与野生型细胞周期蛋白-GUS表达模式类似，然而，发芽4天后，与野生型相比在一些nakr1-1根中细胞在根尖分生组织中表达细胞周期蛋白-GUS明显减少。在第一个3 DAG，根小柱细胞内淀粉积累无显著差异。4 DAG，在nakr1-1根中在最外层的根小柱细胞层淀粉积累消失； 因此与野生型根中的四个层相比只有三层的小柱细胞表现出淀粉积累。nakr1-1根小柱细胞淀粉积累的异常与静态中心细胞的缺陷是一致的。然而，在nakr1-1小柱干细胞内无分化迹象被检测到，在nakr1-1鼻小柱干细胞层内没有显示可染的淀粉颗粒。发芽前2周记录Col-0 和 nakr1-1突变体初生根的生长.Col-0 和 nakr1-1间根生长的明显差异直到4 DAG初生根在一个缓慢但恒定的速率生长时才被发现. 这些结果表明，nakr1-1根顶端分生组织的缺陷发生在发芽后3-4天. NaKR1在韧皮部特异表达 为了研究表达模式， 一个完整的β-葡萄糖醛酸(GUS)酶融合基因(NaKR1pro:NaKR1-GUS)在Col-0中表达，并且分析10个独立的转化。在胚胎或吸胀（但没有发芽）的种子中没有发现GUS染色（图5A）。在发芽后一天，在10%的幼苗中观察到GUS染色。在根茎交界处的脉管系统中发现GUS活性并且较小的程度上在下胚轴（图5b）。在2天后在整个幼苗的脉管组织中发现GUS活性（图5c）。在更为成熟的植物中，强的GUS染色被发现在莲座的维管组(图 5D)织和茎生叶(图5E)中。在花组织，中GUS染色主要定位于萼片和花的花丝和角果的花梗。（图5F和5G）。根和叶的叶柄横截面显示表达在脉管系统的韧皮部，而不是在木质部。 NaKR1 表达(At5g02600) 此前曾报道称为同伴细胞特异性。这是基于基因芯片结果和cDNA文库对分离纯化的伴侣细胞原生质体，核，或孤立的韧皮部组织的转录本分析的结果。 在以往的实验中histoneB2-GFP的表达由根中韧皮部的被NaKR1启动子标记的细胞核驱动。在根尖，histoneb2 GFP荧光仅在韧皮部中发现。苯胺蓝染色的筛板鉴定在筛管毗邻细胞核中含histoneb2 GFP荧光。这证实了NaKR1是在同伴细胞中表达的。整个基因GFP(NaKR1pro:NaKR1-GFP)融合互补的nakr1-1突变体的表型，这表明NaKR1-GFP融合蛋白的功能。T2代幼苗使用共聚焦显微镜进行观察。在根中，GFP荧光被发现在维管内木质部两侧的平行细胞内指示韧皮部定位。在根尖，NaKR1-GFP荧光在原细胞分裂区近端的细胞中观察到和横向根。在细胞质和细胞核的荧光明显。 (责任编辑：qin) |