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1.2 实验方法

1.2.1 叶绿色含量的测定

    采用丙酮乙醇混合提取法测量叶片中的叶绿素含量。取正常生长的突变体yl1和野生型蜀恢相同部位的叶片0.05g，剪成2mm左右的小块，放入含有20ml提取液的玻璃试管中，常温黑暗放置24小时，每隔4小时轻微摇晃，使叶绿素提取充分。提取液由丙酮、乙醇、水，按照4.5:4.5:1的比例混合配制成。用分光光度计测量混合提取液在663nm和645nm波长处的吸收峰，每个样品重复三次，每组样设置3个平行对照，取平均值，根据公式计算叶绿素含量。

    计算公式：

               叶绿素a的含量=（12.7D663—2.59D645）×0.4

               叶绿素b的含量=（22.9D645—4.67D663）×0.4

                   总叶绿素含量=叶绿素a含量+叶绿素b含量

1.2.2 叶绿体发育的电镜观察

取突变体和野生型旗叶的叶片，剪成2mm×2mm大小的方片，注意应尽量避免取到叶脉。将剪好的叶片浸泡在含2.5%戊二醛固定液的1.5ml的EP管中，抽真空15min，4℃过夜。然后按照下列步骤处理样本：

1）用移液枪吸除EP管中的戊二醛固定液，用浓度0.1M，PH值为7的PBS缓冲液漂洗叶片去除戊二醛，每次15min，漂洗3次。

2）用终浓度为1%的锇酸溶液浸泡叶片2h左右。

3）吸除锇酸固定液，用0.1M, PH7的PBS缓冲液洗涤叶片3次，每次15min。

4）用30%、50%、70%、80%、90%五种浓度的乙醇溶液依次浸泡锇酸固定后的叶片，每次15min，再用无水乙醇处理20min，最后用纯丙酮处理20min。

5）将包埋剂与丙酮按1:1的比例混合均匀，处理样品1h。

6）将包埋剂与丙酮按3:1的比例混合均匀，处理样品3h。

7）最后用包埋剂包埋叶片，70℃过夜，样品处理完成。

    观察时，取出包埋好的叶片，先用Reichert超薄切片机切成厚度为70-90nm的超薄切片，然后再用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液，分别染色15min，即可在Hitachi H7650透射电镜下，观察叶绿体超微结构。

1.2.3 定位群体的构建

以籼稻品种“蜀恢”突变体yl1为母本，为了使后代获得较大差异的遗传背景，以粳稻品种“日本晴”为父本，进行杂交得到F1代，确定其突变表型的显隐性。F1代进行自交，F1代植株上结出的种子为F2代，播种种子并细心培育。在苗期观察植株的叶片颜色，统计F2代中表型为显性和隐形的个体数目，确定突变表型是否由单基因控制。