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1、克隆拟南芥中BIO同源基因At4g32295和At3g24150，并利用pCAMBIA13011载体构建过表达载体。

2、将拟南芥同源基因At3g24150与At4g32295的过表达载体通过根癌农杆菌介导法转化拟南芥，筛选转基因植株，获取纯合后代。

3、检测转基因植株的表型变化，观察其与野生型的表型差异。以期分析并阐述其基因功能。

2  转百脉根BIO同源基因拟南芥的生长以及表型分析

拟南芥中编号为At4g32295和At3g24150的基因碱基序列与百脉根BIO基因相似性较高，其中At4g32295有2个转录本，分别是At4g32295.1和At4g32295.2。以野生型拟南芥Columbia-0生态型作为实验材料，设计相应引物分别克隆拟南芥At4g32295.1、At4g32295.2、At3g24150基因，并构建相应的过表达载体35S:At4g32295.1、35S:At4g32295.2、35S:At3g24150。

2.1  材料与试剂

2.1.1  材料和菌株

Columbia-0生态型拟南芥，种植于光照培养室，16h光照/8h黑暗，湿度70%，温度22℃；

大肠杆菌菌株DH5α和农杆菌菌株GV3101。

2.1.2  主要试剂

限制性核酸内切酶、Trizol、DNaseⅠ、RNase抑制剂、T4连接酶、Premix Taq、Maker、氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素、引物等。

2.1.3  主要仪器

高速台式冷冻离心机、电泳仪、自动凝胶成像系统、恒温水浴锅、PCR扩增仪、控温摇床、超净台、-70℃超低温冰箱等。

2.2  实验方法

2.2.1  基因克隆

2.2.1.1  Trizol法提取拟南芥Total RNA

(1) 用浓度为75%的消毒酒精擦拭实验台面、移液枪、离心管架、保温瓶等器具，准备各种用具和试剂。

(2) 取0.5g~1g左右的新鲜拟南芥组织放入灭菌后的研磨小玻璃管中，研磨至破碎，再加入0.5g~1g组织/ml的Trizol试剂，研磨均匀，再倒入预冷的1.5ml离心管中，上下剧烈振摇3min及以上，室温静置5min及以上，以4℃，12000rpm的设置离心10min。

(3) 吸取上清液至1.5ml的新离心管，加入200μl的氯仿，上下剧烈振摇3min，室温放置至分层，再以4℃，12000rpm的设置离心10min。重复（3）操作一次。

(4) 吸取上清液，加入500μl预冷的异丙醇，混合均匀，室温下静置5-10min，以4℃，12000rpm的设置离心10min，弃上清。

(5) 加入1ml浓度为75％的乙醇溶液，轻柔振荡离心管，悬浮沉淀，再以4℃，12000rpm离心5min，室温下晾干至半透明状。

(6) 加入20-50μl的DEPC-H2O溶解沉淀，60℃恒温水浴10min，取1μl样液检测RNA样品浓度和纯度，另取3μl样液电泳，检测RNA样品的完整性。

(7) 冻存于-70℃超低温冰箱。

2.2.1.2  RNA逆转录合成cDNA

使用SuperRT cDNA Kit，步骤如下：

(1) 将dNTP Mix、Primer Mix、RNA Template、RT Buffer、DTT、HiFi-MMLV和RNase-Free Water溶解，置于冰上备用。