利用群体感应合作行为菌群模型研究合作种群的进化(3)
时间:2017-04-20 12:46 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
由于未知的原因，lux群体感应系统的最佳温度是30摄氏度，并且对温度极其敏感，因此本文中所有观察群体感应现象的培养实验，培养温度均为30摄氏度。 1.４pPOPglac质粒简介 pPOPglac质粒是由本实验室构建的一个质粒，其结构如下图（图1.1）所示： 图1.1 pPOPglac质粒 如图1.1所示，pPOPglac质粒中含有卡那霉素抗性基因，由lac启动子控制的luxR基因以及luxI基因。以及由luxbox启动子控制的α肽基因三部分。 卡那霉素抗性基因，顾名思义，既能使细菌在含有卡那霉素的培养基中生长，在此不多加赘诉。 Lac启动子，即大肠杆菌中的乳糖操纵子，可由IPTG以及半乳糖激活启动。 luxI基因，可以控制合成AHL，AHL是海洋细菌费氏弧菌[1] ( Vibrio fischeri )的群体感应的信号分子，细菌在生长过程中将会不断分泌AHL，因此，环境中AHL的浓度可以说代表了菌体密度，当AHl的浓度达到一定阈值，即菌体密度达到一定阈值，AHL将会和r蛋白结合，形成R*蛋白。 luxR基因，控制合成R蛋白，当AHl的浓度达到一定阈值，即菌体密度达到一定阈值，r蛋白将会和AHL结合，形成R*蛋白。 Luxbox启动子，能够和R*蛋白结合，从而被激活诱导生成α肽 α肽基因可以生成α肽。 1.5大肠杆菌乳糖代谢途径 理解大肠杆菌的乳糖代谢途径对于理解本文内容具有非常重要的意义，因此，在这里简述一下大肠杆菌乳糖代谢途径。 大肠杆菌的乳糖代谢由lacZ、lacY以及lacA三个基因操纵，这三个基因又由lac启动子操控。 lacZ基因合成半乳糖苷酶，其作用为将乳糖分解为半乳糖与葡萄糖，lacY基因合成乳糖通透酶，其作用为将乳糖搬运入细胞内。而lac启动子可由半乳糖激活启动。 在自然条件下，大肠杆菌内不存在半乳糖，但是lac启动子在自然条件下存在表达泄漏的问题，即在无激活分子的情况下也能少量表达后续基因。即在菌体中始终存在少量的半乳糖苷酶与乳糖通透酶，可以使操纵体系不会被完全锁死。 1.6本研究的主要内容 本文在m9培养基中培养大肠杆菌分别使m9培养基中的碳源为葡萄糖，乳糖以及二者皆有，并在其中接入含有pPOPglac质粒的top10f，由于top10f的lacZ基因缺失了α肽，倘若我们的设想正确，那么菌体一开始无法利用乳糖，在菌体密度达到一定阈值时，luxbox启动子启动，开始合成α肽，α肽与半乳糖苷酶进行α互补成为完整的半乳糖苷酶，即达到一定菌体密度时，含有pPOPglac质粒的top10f可以利用乳糖，既可以观察到特殊的生长曲线。 二 材料与方法 2.1实验器材 表一 本实验所用的实验试剂 实验试剂 生产厂家 SD7002-LB Broth Medium-250G SD7003-LB Broth Agar-250G 生工生物工程（上海）有限公司 生工生物工程（上海）有限公司 卡那霉素粉末 生工生物工程（上海）有限公司 氨苄青霉素 生工生物工程（上海）有限公司 EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Minipreps Kit BIO BASIC INC. Taq酶 上海申能博采公司 DNA marker 上海捷瑞生物工程有限公司 50×TAE电泳缓冲液贮存液 生工生物工程（上海）有限公司 溴化乙锭（EB） 生工生物工程（上海）有限公司 溴酚蓝 T4 DNA连接酶 上海申能博采公司、 上海申能博采公司 UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒 生工生物工程（上海）有限公司 一步法制备感受态细胞溶液SSCS 生工生物工程（上海）有限公司 (责任编辑：qin) |