甘薯几丁质酶02314基因cDNA的克隆及序列分析(2)
时间:2020-06-17 21:26 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.1 实验材料、试剂及仪器 1.1.1甘薯块根 南京92，高抗黑斑病，烟台252，高感黑斑病，由江苏省徐州市农科院提供。分别洗净，切成小块，分装后放入-80℃冻存。 1.1.2主要试剂天根 （Tiangen） 生化科技有限公司生产的多糖多酚植物总 RNA提取试剂盒，普通 DNA 产物纯化试剂盒，琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒，质粒小提试剂盒与2ⅹTaq PCR Master Mix 等；东洋纺(Toyobo)生物科技有限公司生产的 ReverTra qPCR RT Master Mix；宝生物（TaKaRa）有限公司生产的SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)；奥博星生物技术有限公司生产的 LB营养琼脂；江莱生物有限公司生产的SOC肉汤；北京索莱宝科技有限公司生产的50ⅹTAE；普洛麦格生物技术有限公司生产的 pGEM-T 载体；BioLabs 生产的 Phusion High-Fidelity PCR MM w/HF Buffer；Biomiga 生产的100bp DNA ladder；上海捷瑞生物技术有限公司合成的引物 02314 与内参 GADPH；生命科学学院植物生理实验室提供的Goldenview， 6ⅹ Loading Buffer， 异丙醇，氯仿， 氨苄青霉素， 无水乙醇， DEPC水，dATP，蒸馏水等。 1.1.3 主要仪器 移液枪（Eppendorf）， PCR 仪（型号： DTC， TianLong PCR Thermal Cycler），桌上式洁净工作台（型号：VD-650 型，上海苏净实业有限公司），电子天平（型号：BS 110 S， Sartorious），立式压力蒸汽灭菌锅（型号：LDZX-50KBS），恒温混匀仪（型号：JN110-3，苏州吉米诺生物技术有限公司）， 漩涡混匀器（型号：WS-861，太仓市科教器材厂），高速台式冷冻离心机（型号：TGL-18000CR，上海安亭科学仪器厂），电泳仪（型号：DYY-6C，北京市六一仪器厂），电热恒温培养箱（型号：DHP-9052，上海一恒科技有限公司），电热恒温水浴锅（型号：DK-S24，上海一恒科学仪器有限公司），微量紫外分光光度计（型号： NANODROP 2000c，赛默飞世尔科技公司），实时荧光定量 PCR 仪（型号：StepOnePlus，美国应用生物系统公司），全自动凝胶成像仪（型号：240，上海领成有限公司），制冰机等。 1.1.4 培养基以及试剂的配制 含 Amp的 LB 固体培养基：使用 AOBOX 02-137 型，称取32g，加入1L蒸馏水，加热煮沸溶解后 pH 调至7.0 分装，121℃灭菌20 分钟，待冷却至50~55℃时加入氨苄青霉素（Amp）（100μg/mL），倒平板。 LB液体培养基（1L）：胰蛋白胨（Tryptone） 10g，酵母提取物（Yeast Extract） 5g，NaCl 10g，pH 7，分装后121℃灭菌20 分钟，冷却后4℃保存，使用时再加入氨苄青霉素（Amp）（100μg/mL）。 SOC培养基：使用江莱生物 SOC 肉汤，每1L蒸馏水中加入31.4g，pH 7，分装，冷却后4℃保存。 IPTG 储液：称取 0.5g IPTG 粉末，加入 2mL 蒸馏水溶解，补加至 2.5mL后过注射型过滤器，-20℃冻存。 X-Gal储液（20mg/mL）：0.2g X-Gal, 二甲基甲酰胺（DMF）10mL，无需过滤除菌，-20℃避光冻存。 1ⅹTAE：使用 Solarbio 生产的 50ⅹTAE，每 10mL 中加入 490mL 蒸馏水。 蓝白斑筛选含 Amp 的 LB 固体培养基：每个平板上加入 5μL IPTG 和 40μL X-Gal，涂布，在使用前 1h进行配制。 1.1.5其他材料 大肠杆菌（型号：DH5-α，由生命科学学院植物生理实验室提供），枪头，EP 管，研钵，镊子，药匙等 2 实验方法与步骤 2.1 基因02314的克隆与测序 2.1.1总 RNA提取与检测 由于甘薯块根富含多糖，而多糖可能会抑制 RNA 提取过程中酶的效果【9】，因此使用多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒提取RNA， 按照说明书上的方法进行提取，并在提取完成后进行分装，每管5μL，放入-80℃冰箱冻存。1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整度， 微量分光光度计测量 RNA含量与纯度， 分装， 每管5μL，放入-80℃冰箱冻存。 (责任编辑：qin) |