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引言

    内生菌（Endophy）由De Bary第一个进行阐述，指生活在植物组织和植物表面的微生物、表生菌[1]。Petrini将Carrol对内生菌的观点进一步衍生，将内生菌诠释为在整个生活史的某一时段，生活在植物组织内对植物组织没有产生伤害的菌种，同时也包含腐生菌，病原菌和菌根菌。目前为止，内生真菌的研究范围已经不再局限于之前的那些植物，而是开始向一些低等的孢子植物拓展，比如苔藓、蕨类和地衣[2]。1993年,科学家发现了产抗癌物质紫杉醇（Taxol）内生真菌，开始了对药用植物内生菌的深入研究。虽然紫杉醇产量很低,而且不具有重要的商业价值,但是科学家们认为其进一步开发的前景是非常诱人的[3]。

紫杉醇、长春新碱和鬼臼毒素是人类发现的存在于植物中的一类天然抗癌药物[4]。随着人类发现可产生紫杉醇内生菌以后,就逐步把精力放在对药用植物内生菌的研究上。Strobel GA等从雷公藤的的茎中分离到一株内生真菌Cryptosporiopsis quercina，能产一种肽类抗生素Cryptocandin[5]。它能够抑制人类的病原真菌。植物内生菌的产物还有抗病毒的作用[8]。内生真菌Cytonaema sp.产生的p一三缩酚酸的同分异构体能够很好的抑制细胞巨化病毒的蛋白酶[6]。植物内生菌产生的生物碱,会对线虫、食草昆虫产生毒性。人类发现植物内生菌能产生植物生长激素类物质。一项研究表明内生真菌对兰花的生长有促进作用[7]。

本课题是从采摘自扬州，徐州等地的植物标本中分离出多种植物内生菌，对其进行纯化源`自·优尔.文/论:文'网,www.youerw.com，并进行发酵培养后，检测其代谢产物的抗肿瘤活性。从而来发现我们日常生活周围的植物中也是有含有抗肿瘤活性的内生真菌的存在的，一些不起眼的植物也是有研究价值的。

1材料与方法

1.1 样本

   香樟，冬青，广玉兰，石楠，竹子等采自扬州。选定5-10颗目标树木，做好标记并登记好树名。在每棵树上选取10片左右树叶（不要采取枯叶，烂叶），采取树叶的时候连茎一并采取。分装到各个保鲜袋，并做好标记，把树名写在纸条上放入保鲜袋中。

1.2 培养基

    PDA培养基的制作方法：用电子秤称取200g马铃薯，洗干净切成块状，加纯净水1000ml煮沸30min，用纱布过滤，再加10-20g葡萄糖、17-20g琼脂，充分溶解后趁热用纱布过滤，分装锥形瓶，每个锥形瓶约200ml，用蒸汽灭菌锅灭菌20min[8]。

1.3试剂和仪器

试剂：MTT ,70%乙醇,3%次氯酸钠，PDA培养基，无菌水, 二甲基亚砜

仪器：超净工作台、恒温培养箱、漏斗、pH试纸、微量注射器、96孔板、水浴灭菌锅、硅胶G板、玻璃平板、紫外线灭菌操作台超速离心机

2 实验方法        

2.1内生真菌的分离：

2.1.1样本处理

把树叶用自来水冲洗3遍，用手来回揉搓，但勿太用力，否则会伤其表面组织。

2.1.2采取样品

在每个树叶上取5个样本，分别在左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取25mm2的叶片[9]。若是采集了比较粗的树干和果实，那就用刀切开，然后在提取样本，样本尽量剪得适中。分别对每种植物的叶，茎，枝取样，每个部位放入两块PDA培养基中,尽量多剪点样本，防止后续杀毒灭菌中被清洗冲掉。所有剪好的样本放入50ml的离心管，并在离心管外表面做好标记。