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   本实验构建了含有glgB基因的植物表达载体pBIN19-glgB，然后将植物表达载体pBIN19-glgB通过电激转化法导入根瘤农杆菌 EHA105中。通过根癌农杆菌介导的方法将pBIN19-glgB转入马铃薯中，并对马铃薯转基因植株进行PCR检测，最终获得了马铃薯转基因植株。

2  材料与方法

2.1  材料

2.1.1  质粒与菌株

 克隆载体pUC19、大肠杆菌E.coli DH5α购自TaKaRa公司；中间载体pUC19/SBD2、植物表达载体pBIN19/SBD2、根瘤农杆菌菌株EHA105 (具有利福平抗性)为本实验室保存。

2.1.2  酶与试剂

  Pfu DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、各种限制性内切酶、DNA marker、卡那霉素、氨苄青霉素、利福平购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于Promega 公司；PCR 引物合成和基因测序由上海生工生物工程公司完成；其它试剂为进口或国产分析纯。

2.1.3　植物材料

 以马铃薯栽培品种Desiree的无菌苗为植物材料，取苗龄3周的生长状态良好的无菌苗茎段为转化的受体材料。

2.1.4  培养基

LB 培养基：蛋白胨10 g/L， 酵母提取物 5 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7.2， 氨苄青霉素和卡那霉素的使用浓度分别为100 mg/L、50 mg/L。

预培养基(M1):MS + 0.1mg/L 2,4-D + 1mg/L 6-BA；

共培养基(M2):MS + 0.1mg/L 2,4-D + 1mg/L 6-BA + 100μM AS；

愈伤组织诱导培养基(M3):MS + 0.1mg/L 2,4-D + 1mg/L 6-BA +250mg/L cefo50mg/L Kan50mg/L Kan；

筛选分化培养基(M4):MS + 1mg/L GA3 + 1mg/L ZT +250mg/L cefo +50mg/L Kan；

生根培养基(M5):MS +250mg/L cefo + 50mg/L Kan。

以上培养基中，均添加蔗糖30g/L和琼脂8g/L, pH为5.8。

2.2  方法

2.2.1  大肠杆菌基因组DNA的提取

从保存的平板上挑取E.coli DH5α单菌落，接种于LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜，取1.5ml培养好的菌液，5000r/min离心2min，收集菌体。向菌体沉淀物中加入500μl TE，反复吹打，使之悬浮。加入10μl溶菌酶（0.1g/ml），37℃水浴1h。然后加入10μl 20%SDS溶液，混匀，37℃下水浴10min。加入100μl 5M NaCl 溶液，混匀，65℃处理10min；然后于12000r/min 离心 15min，收集上清液。向上清液中加入2 μl RNAase， 37℃水浴30min。加入等体积的苯酚/氯仿，混匀，12000r/min 离心5min。加入等体积的氯仿，混匀，12000r/min 离心5min。加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的KAC 溶液(3M，pH8.0)混匀，于-20℃保存 1h。12000r/min 离心15min，弃上清液，沉淀用75%乙醇洗2次，置于室温干燥后，溶于30μl TE 溶液中，置4℃保存备用。源-自/优尔+文,论`文'网]www.youerw.com

2.2.2  大肠杆菌glgB 基因的PCR扩增

根据NCBI上已经登录的大肠杆菌糖原分支酶基因序列（GenBank登录号：M13优尔.1），运用Primer Premier 5.0 和Olig6.0 软件设计引物，上游引物glgB-F的序列为： 5'-GTGTCGACCATGGCCGATCGTATAG-3',含Sal I 酶切位点和起始密码子ATG；下游引物glgB-R的序列为：5'-GGAGCTCATCATTCAGCCTCCCG-3' , 含SacI酶切位点和终止密码子TCA 。以大肠杆菌DH5α的基因组DNA为模板，用引物glgB-F和glgB-R 进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL,其中上下游引物各1μL， dN TP 4μL,模板DNA 1μL，10×PCR buffer 5 μL，Taq 酶 0.5μL,加ddH2O至总体积50μL；反应条件为95℃预变性5 min， 95℃变性60s， 55℃退火50s; 72℃延伸60s,共30个循环， 72℃再延伸10 min。得到的PCR 产物用胶回收试剂盒回收。

2.2.3  重组质粒pUC19-glgB的构建

PCR 产物胶回收后用Sal I和SacI 酶对PCR 纯化产物及克隆载体pUC19进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离及DNA胶回收纯化。回收的产物按一定比例用T4 连接酶进行连接反应, 16℃连接过夜。连接产物转化低温CaCl2 制备的大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100μg/mL 氨苄青霉素的LB 平板中，次日挑单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜,先取少量菌液煮沸作为模板进行菌落PCR 检测，将菌落PCR 筛选呈阳性的菌落抽提质粒DNA，并用Sal I和SacI内切酶进行双酶切鉴定，筛选出克隆产物为阳性的菌株。经PCR以及双酶切鉴定均为阳性的质粒进行序列测定，测序结果在NCBI 网站进行blast比对。 (责任编辑：qin)