毕业论文移动版

其次，最适合大肠杆菌生长的温度在 37∼39℃之间，在此温度下表达外源蛋白极易生成包涵体［8］，所以降低培养温度也是提高可溶蛋白表达含量的有效方法之一。在高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。而在低温条件下细菌生长缓慢，蛋白质合成也相应较慢，新合成的蛋白质会有更充分的时间折叠。同时降低培养温度也能降低重组蛋白降解的速率，提高重组蛋白的稳定性［9］。不过低温也有一个限度，通常为8∼10℃，低于该温度，菌体生长将会停止。所以本实验研究了25℃和37℃两种温度下的表达情况，从而确定优化温度。

最后，诱导剂对可溶蛋白表达的影响更是不可忽视的。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）在乳糖操纵子中的作用与异乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。但是化学试剂IPTG的毒副作用也必须考虑在内，培养时间的长短也影响着菌体浓度、菌液pH值等因素，所以本实验研究了IPTG浓度及诱导时间对GASBD2蛋白可溶性表达的影响。

本实验以含有质粒pET28a/GASBD2的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株为实验材料，考察GASBD2蛋白在LB和TB两种培养基、25℃和37℃两种诱导温度、不同的IPTG浓度和诱导时间下的表达情况，确定GASBD2蛋白可溶性表达的最优化条件。

2.实验材料

2.1 菌株

含有表达质粒pET28a/GASBD2的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

2.2 主要仪器 

台式冷冻恒温振荡箱，电热恒温鼓风干燥箱，超净工作台，电子天平，分光光度计，高压蒸汽灭菌锅，垂直板电泳槽及配套的玻璃板，恒温恒压电泳仪，电磁炉，脱色摇床，通风柜，凝胶成像仪等。

2.3 主要试剂 

1M IPTG、50μg/ml Kana、30%(W/V)丙烯酰胺、l.5M Tris-HCL(pH8.8)、10%(W/V)过硫酸铵、5×Tris-Glycine buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)、5×SDS-PAGE loading buffer、TEMED、考马斯亮蓝R-250染色液、考马斯亮蓝染色脱色液、结合缓冲液、4M 咪唑、洗脱缓冲液、20%乙醇(树脂保存液)、5×Tris-Glycine buffer(NADE电泳缓冲液)、5×NDAE loading buffer Ni2+-NTA购自于Novagen公司，IPTG、Kana、考马斯亮蓝R-250、聚丙烯酰胺、过硫酸铵、咪唑购自于南京天为公司、玉米淀粉购自于Sigma公司。

2.4 培养基  

LB培养基（Luria–Bertani培养基）、TB培养基（Tartoff- Hobbs Broth/Terrific Broth，1987）的配制参考《分子生物学实验指南》（第2版）。

3. 实验方法

3.1 菌种活化

挑取含有重组质粒pET28a-GASBD2的大肠杆菌BL21(DE3)的单菌落，接种于10 mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，220rpm振荡培养12h。

3.2 不同培养基对GASBD2蛋白可溶性表达的影响

取2 mL新鲜的培养液，分别转接于200 mL LB和TB液体培养基中，在37°C，转速为220rpm的条件下培养至OD600 为0.8时，加入IPTG至最终浓度为1.0 mM，在37°C下诱导培养5h。

诱导培养结束后，取200 mL培养液，在4℃下，5000rpm离心10min，收集培养菌体。菌体沉淀用50 mL Tris-HCl (20mM，pH 8.0) 洗涤两次；然后菌体沉淀用20mL裂解液 (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0) 重新悬浮，冰上放置30min。之后在冰水中用超声波破碎仪 (VCX750, SONICS, USA) 对菌体进行破碎20min（破碎3s，间隔6s），功率为300W。最后，破碎液4℃、12000rpm离心10min，取上清液保存样品。

样品用15% SDS-PAGE凝胶电泳( 具体操作参见3.6 SDS-PAGE 凝胶电泳)进行分析，从而确定GASBD2蛋白可溶性表达的最适诱导培养基。