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    近年来，毕赤酵母表达系统已被认为是极为成功的外源蛋白表达系统之一[10]，以酵母作为工程菌表达外源蛋白的途径也日益引起研究单位的重视。酵母是低等真核生物，与大肠杆菌相比，不但具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，而且具有真核生物对表达的蛋白质进行正确的加工，修饰，合理的空间折叠等功能，能有效的克服大肠杆菌系统缺乏对蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此毕赤酵母非常有利于真核基因的表达，其表达系统也受到越来越多的重视和利用。

    经过对氨基酸序列的分析，发现弹性蛋白酶psudolysin的氨基酸序列中存在三个N-糖基化修饰位点（Asn-Xaa-Ser/Thr）。当其弹性蛋白酶基因在真核的毕赤酵母中表达时，重组酶蛋白就会被N-糖基化修饰，而N-糖基化修饰对酶蛋白的稳定性、活性以及表达水平可能有着重要的影响，因此我们有必要研究N-糖基化修饰对重组酶的影响[3]。利用定点突变技术来改造N-糖基化修饰位点的方法是一种用来优化重组弹性蛋白酶活性、稳定性以及表达量的手段，本论文主要研究了利用定点突变技术来改造天然的N-糖基化修饰对重组弹性蛋白酶表达量的影响。源.自|优尔,:论`文'网www.youerw.com

2 实验材料

2.1 质粒和菌株

含有目的基因的Pseudomonas aeruginosa C11菌株由论文指导老师韩铭海老师提供；大肠杆菌感受态DH5α购自上海捷瑞生物工程有限公司；克隆质粒pGH-T质粒购自上海捷瑞生物工程有限公司；毕赤酵母表达质粒pPIC9K购自上海捷瑞生物工程有限公司，由本实验室保存。

2.2 酶和试剂及各试剂配制方法 

2.2.1 酶和试剂

限制性内切酶EcoRI、AvrII和T4 DNA连接酶购自Fermentas公司，Pfu DNA高保真聚合酶购自生工生物工程（上海）有限公司，ScaI酶购自Fermentas公司，DNA Marker DL10001、DNA Marker DL2501和DNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

2.2.2 试剂配制方法

（1）10×YNB（13.4%的无氨基酸酵母氮源），134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存；

（2）500×B（0.02%生物素），生物素20mg/100mL水，过滤灭菌，4℃保存；

（3）10×D（20％葡萄糖），200g D-葡萄糖溶于1L水，过滤灭菌，4℃保存；

（4）10×GY（10%的甘油），100mL甘油溶于900mL水，过滤灭菌，4℃保存；