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     与CaCl2法相比较，一步制备法的优点是，操作方便，只加一种试剂即可, 且不需要另加保护剂就可直接冻存，更快捷稳定，转化时，该法也更方便，此法转化时不需要热激。但一步法对实验操作要求所用器具一定要清洁，制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作，该方法的转化效率也相对较低，适用于对转化率要求不高的实验。

     大肠杆菌由于遗传背景清楚,容易培养, 克隆载体与表达载体种类繁多,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统[9]。大肠杆菌BL21 (DE3)菌株是目前最常用的外源基因异源重组表达宿主菌株，其表达载体的构建往往先在DH5a菌株中进行，表达载体构建成功以后再提取质粒转化BL21菌株，并进一步诱导外源基因表达。由于该过程中直接提取构建好的重组质粒转化BL21感受态细胞，因而对感受态细胞的转化效率要求不高，可以采用简单方便的一步法完成。本文正是基于此，探讨大肠杆菌BL21菌株的一步法感受态细胞的制备和转化的可行性。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和质粒

大肠杆菌BL21（DE3）菌株，用于制备感受态细胞；

pET29a，保存于大肠杆菌DH5a菌株中，卡那霉素（KM）抗性；

pET29a-gfp，保存于大肠杆菌DH5a菌株中，卡那霉素（KM）抗性；

pUC19，保存于大肠杆菌DH5a菌株中，氨苄（AMP）抗性；

pNW33N，保存于大肠杆菌DH5a菌株中，氯霉素（CM）抗性；

1.2 试剂和溶液

本文实验过程中所用的酵母粉蛋白胨和PEG3350为进口试剂，分别购自Oxide（英国）和Sigma（美国），各种抗生素购自生工生物工程有限公司（中国上海），其他普通试剂均为国产分析纯试剂。

TSB：LB PH6.1，10% PEG3350，5% DMSO，10% 甘油，10mM MgCl2，10mM MgSO4，高压灭菌。

5*KCN：0.5 M KCl，0.15 M CaCl2，0.25 M MgCl2。配几mL，过滤除菌，-20℃保存，可反复冻融。

溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH8.0）12.5mL，0.5M EDTA（pH 8.0）10mL，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500mL。高压灭菌15min，贮存于4℃。

溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1mL，10%SDS 1mL，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。

溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300mL，冰醋酸 57.5mL，加ddH2O至500mL。4℃保存备用。

核酸电泳缓冲液（50*TAE，1000mL）：Tris碱242g ，冰乙酸57.1mL，0.5mol/L EDTA（pH 8.0）100mL。

工作液浓度为1*TAE