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2 实验材料与实验方法

2.1 实验材料

购外观良好，无病虫害，无机械损伤的新鲜嘎啦果。置于4℃冷藏备用。

2.2 试剂与仪器

试剂：邻苯二酚、磷酸氢二钾、氢氧化钠、抗坏血酸、柠檬酸、氯化钠、草酸等。

仪器： TGL-16高速台式冷冻离心机  北京长流科学仪器公司；HH-S恒温水浴锅  金坛市亿通电子有限公司；722s型分光光度计  上海精密科学仪器有限公司；海尔冰箱；PHS-3C pH计  上海仪电科学仪器股份有限公司；WH-3微型漩涡混合仪  上海沪西分析仪器厂有限公司等。

2.3 实验方法

2.3.1 粗酶液的制备

将已预冷的苹果清洗、去皮、去核、切块，称100g加入已预冷的磷酸缓冲液，在高速组织捣碎机中匀浆1min，8层纱布过滤，取滤液于4℃下12000r/min离心20min，得到上清液即为PPO粗酶液，于4℃保存备用。以上操作步骤均在4℃以下进行，磷酸缓冲液为磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（浓度为0.05mol/L，pH为6.0）。

3 多酚氧化酶的性质研究

3.1 工作波长的选择

将2.0ml浓度为0.2mol/L邻苯二酚溶液和2.0mlpH值6.0的磷酸缓冲溶液加入到试管中，然后加入0.2ml的粗酶液，混匀后立即倒入比色管中，记录体系反应产物在可见光波长350～470nm下的吸光度见图1所示。

PPO酶促反应体系的波长扫描图

由图1可以看出在从350nm后吸光值一直呈下降的趋势，但当反应液在380nm处时吸光值便出现上升，随着波长的改变反应液在410nm处的吸光值逐渐增大，当波长为410nm时，吸光值已经增大到0.327，并形成一个大的波峰，说明该酶促反应的产物最大吸收波长在410nm处，故以此波长处的吸光度来衡量PPO酶促反应速度的大小。