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4、50*TAE: Tris242g; Na2EDTA-2H20 37.2g;冰醋酸 57.1 mL，加去离子水充分溶解定容至IL。

5、TE buffer：1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml、0.5M EDTA PH=8.0 1ml定容到500ml 121℃灭菌20分钟。

6、TSB：10%PEG3350、5%DMSO、10%甘油、10mM MgSO4、用LB pH6.1定容，121℃灭菌20分钟。

7、5*KCM：0.5M KCL、0.15M CaCl2过滤除菌

2.2.2里氏木霉的活化培养

将实验室保藏的里氏木霉菌种接种到PDA固体培养基上进行活化培养，培养温度28℃，培养时间2d~4d，然后接种到PDA液体培养基中，28℃，200r/min深层发酵2d[11]，待里氏木霉长出较多菌丝为止。

2.2.3里氏木霉菌体的分离

用抽滤的方法获得里氏木霉的菌丝体。首先将抽滤用的滤纸以及布氏漏斗灭菌，然后将培养好的里氏木霉的菌丝体通过真空泵用抽滤瓶得到较干燥的的菌丝体 。再通过烘干的方法得到干燥的菌丝体，以便提取总DNA组。

2.2.4里氏木霉总DNA的提取

CTAB法提取真菌基因组DNA是较常用的一种方法[12] [13]，由于真菌的细胞壁较厚难以破壁，故需要先用液氮研磨破壁，并用CTAB的与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物却不能沉淀核酸的特性，将核酸分离出来。

称取一定质量的干燥的里氏木霉菌体放入已灭过菌的研钵中，倒入液氮，充分研磨至粉末状。提前称量50ml离心管的质量，将研磨后的粉末倒入离心管中，室温放置1-2min；再称离心管重，计算菌体质量。按照1g样品加入5ml2%CTAB的比例加入65℃预热的2%CTAB充分混匀，置65℃水浴约1h，期间可适当摇匀，期间每隔5-10min混匀一次，取出后放置室温。冷却后，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分混匀，分装置1.5ml的离心管内12000rpm，离心10min。吸上清，装入新的1.5mlEP管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），12000rpm。离心10min再吸上清，转入新的1.5mlEP管中，加入一倍体积的异丙醇，充分颠倒混匀；4℃离心，1200rpm，20min；弃上清加入500μL的70%的乙醇清洗，4℃，12000rpm，5min弃上清，重复一次后，置于吸水纸上倒置晾干，加入TE（20-50ul）溶解；并琼脂糖凝胶电泳检测

2.2.5引物设计和pcr扩增特定片段基因

根据设计引物时注意的三个基本原则[15]，设计出理想的引物通过PCR[14]的手段扩增出我们所需要的目的基因。来达到基因克隆的目的。

据文献报道序列(Saloheimo et al.， 1988)，egl2 全基因具有信号肽序列和两个内含子，第一个内含子位于信号肽序列的上游，第二个内含子位于结构基因内部。将从编码成熟蛋白第一个核苷酸到第二个内含子5’端的序列命名为E1，长265bp；将从第二个内含子3’端到全基因终止密码子的序列命名为E2，长930bp。利用外显子拼接方法，设计两对PCR 扩增引物，用来去除egl2 基因的信号肽序列和内含子，获得egl2 基因的全编码序列[16]。

首先， 扩增E1 片段， 引物序列如下

F1 5' CCGGAATTCCAGCAGACTGTCTGG 3'

RM 5' AGTGCCATCTGTGGTACAGCCAAA 3'

其中F1 加EcoRI 酶切位点，使目的片段经EcoRI 酶切后可插入质粒pPIC9K 中，达到翻译融合，为后续工作做准备。RM 加与E2 片段5’端互补的7 个碱基，与E2的PCR产物可以有一定的概率再经过PCR反应，得到整段基因。