冰核基因2拷贝串联重复细胞表面展示体系的构建(4)
时间:2017-05-18 14:34 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.3.2 工业酶展示 从1998年羧甲基纤文素酶的成功展示至今，利用INP及其截断部分作为锚定单元，已有多种工业酶类在细胞表面得到展示，工业酶的表面展示是非常吸引人的研究领域。宿主菌也包括了大肠杆菌，中度嗜盐菌和恶臭假单孢菌等多种细菌[3]。以这些工业酶类作为乘客蛋白构建的融合蛋白能在宿主菌细胞表面表达并具有酶活，使活菌体本身就可直接进行催化反应，与细胞内表达比较，不仅快速而且简化了反应产物的提取纯化等步骤。 构建目的蛋白基因突变文库，与截断的INP融合表达，使用易检测的方法既可以筛选得到高酶活的菌株，又可将酶活的提高同细菌生长速率结合起来，便于工业生产。例如，采用DNA shuffling的方法构建羧甲基纤文素酶CMCase基因突变文库，将其与INP融合并在细胞表面表达，在羧甲基纤文素平板上生长，生长速率因所表达的蛋白质活性高低而显示出差异，同时菌落形态也不相同[9]。因此，利用这种方法能筛选出在细胞表面高效表达CMCase的菌株进行进一步研究和应用。这一研究为工业酶酶活的提高和定向筛选提供了技术平台。 1.3.3抗原抗体展示 利用INP在大肠杆菌细胞表面表达人类免疫缺陷型病毒I型gp120，表明INP不仅可以表达源自原核生物的外源蛋白质，还可以表达真核生物病毒蛋白质，这为艾滋病诊断及防治艾滋病的活体疫苗的开发提供了新的技术手段[5]。目前利用INP及其部分结构域已经展示多种抗原和抗原决定簇。将病毒抗原展示于无生物毒性的细菌细胞表面，免疫动物后即可刺激动物机体产生高效价抗血清。此后，多种病毒及细菌抗原和抗原决定簇利用INP载体蛋白成功展示于大肠杆菌、沙门氏菌等细菌细胞表面。将乙肝病毒表面抗原和丙肝病毒表面抗原核心蛋白同时展示于减毒沙门氏菌细胞表面，重组活体疫苗制备的抗血清抗体效价显著高于直接注射病毒抗原产生的抗体效价[5]。这一结果证明INP可以同时展示多种病毒抗原，为多种病毒抗原活体疫苗的研究提供了新的思路和实验方向。 在癌症诊断检测领域中，利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的常规方法价格昂贵，阻碍其发展。人体肿瘤蛋白c-myc与多种癌症的发生相关，将c-myc的抗体单链片段ScFv与INP融合并在细胞表面表达，降低了抗体制备、收集等下游工程的难度，比用杂交瘤细胞制备单克隆抗体更经济，更适合规模化生产[11]。此外，全细胞表达单链抗体还可用于生物传感器和生物分离。细胞表面表达融合蛋白，在展示和分离抗体文库，基于细菌的固相免疫测定方法等方面都有较好的应用前景。 1.3.4多肽文库的细菌细胞表面展示 将突变蛋白在噬菌体或其它微生物表面进行展示，然后筛选具有所需特征的蛋白突变体，用DNA shufling技术生成羧甲基纤文素酶(CMCase)基因的系列突变体，并将它们与inaK基因融合，以构建变异基因的细菌细胞表面展示系统，结果成功筛选到CMCase改良突变体。另一种方案是根据显色底物或易观察的菌落表型可进行克隆筛选，而应用与改良酶活性相关的细胞存活力和生长速率的变化来筛选则更直接，但它们也仅适于某些特定的酶类，不能作为筛选酶活改良突变体的一种普遍方法。定向进化在生物催化剂改良上的运用逐渐增多，在更加有效的组合突变技术建立以后，设计快速简捷的方法进行阳性克隆筛选就成为成功应用这项技术的关键[3]。该研究提供了一种对工业酶类(包括些水解酶类)进行定向进化和高效筛选的技术平台。 1.3.5真核基因展示 将人类T淋巴细胞表面蛋白质CD8的部分序列与INP融合，在大肠杆菌表面展示时不仅显示出活性，而且与在T细胞上表达的蛋白质原始结构相同，这一结果证明INP能在细菌细胞表面展示真核基因编码蛋白。此后又有凝血酶，NADPH-细胞色素 P450 氧化还原酶等真核基因编码蛋白成功展示于细菌细胞表面，这些研究拓宽了INP作为载体蛋白的应用范围[10]。 (责任编辑：qin) |