绿色荧光蛋白GFP细胞表面展示体系的构建(3)
时间:2017-05-18 19:38 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.2 绿色荧光蛋白GFP在各领域中的应用 绿色荧光蛋白GFP是一种存在于水母、珊瑚和水螅等腔肠动物体内，在日光下略显绿色，在白织灯下略显黄色，在紫外线照射下发出强烈的绿色荧光的生物发光蛋白。GFP是一个由238个氨基酸残基组成的单肽多链，分子量约27×103道尔顿。为了确定GFP中的哪个部分与荧光特性有关，Dopf等[4]构建了GFP N-末端和C-末端部分缺失的表达载体。通过表达和检测发现，GFP 2-232个氨基酸对文持发光特性是必需的，发射光谱在505nm具有吸收峰，激光光谱在395nm和470nm处有吸收高峰。该蛋白本身是一种形状类似水桶状的圆柱形蛋白，发光基团位于圆筒结构的中心部位，由三个相邻的氨基酸残基(Ser65-Tyr66-Gly67)缩合形成的对羟基苯亚甲基咪唑酮(Ser65-Tyr66-Gly67)[5]。 1.2.1 在生物技术中的应用 1.2.1.1 分子标记 绿色荧光蛋白GFP因其具有稳定的荧光和构建载体方便等性质而常被用来做为标记物。生物界普遍利用GFP重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，然后在荧光显微镜下进行观察。通过测定融合基因中GFP的荧光强度来检测该基因的表达水平。另外，为了了解某一蛋白中蛋白质分子的迁移、定位、构象变化以及分子间的相互作用，通常将GFP分子作为标签融合到主体蛋白中，通过观察荧光标记来了解主体蛋白分子。蒋明[6]等从青花菜中克隆到了多个霜毒病抗性相关基因，并以GFP为报告基因，对其中的BoDMR1进行了遗传转化研究。 因其优异的生物学特性，绿色荧光蛋白GFP终将成为分子标记领域的新宠儿。随着生物理论与技术的不断完善，其应用前景也必将得到进一步的拓展。李倩等[7]以CotX为分子载体，在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示绿色荧光的研究中将GFP作为分子标记。 1.2.1.2 生物传感器 基于蛋白质工程技术开始通过将一个具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一个分子上来设计生物传感器。绿色荧光蛋白GFP具有独特的光信号传导机制，而且，在GFP表达后易被周围环境和蛋白质间的相互作用所影响。因此，该蛋白极其适合用做活细胞体内的光学传感器[1]。 1.2.2 在信号转导中的应用 研究发现，某些突变GFP能够发生荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）[8]。FRET是一种从荧光分子的激发状态到临近基态接受分子之间量子力学能量转移现象。荧光接受分子必须在荧光提供分子释放态所具有的波长范围内接受能量，才能致使荧光共振能量转移FRET发生。 1.2.3 在筛选方面的应用 1.2.3.1 用于细胞筛选 由于GFP具有稳定的荧光能力和快速方便的检测方法，使其在细胞筛选上得到了广泛的应用。Yuk等[9]使用绿色荧光蛋白GFP作为生物标记能快速筛选出在生长抑制环境下，仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。 1.2.3.2 用于药物筛选 将目的物用GFP进行标记，在荧光设备下对其进行追踪，分析该目的物在细胞中的变化情况，如生物活性、离子通道、受体和酶分子分布状况等变化，从而筛选出与体内信号分子功能相似的化合物[10]。 1.2.4 在基因转染方面的应用 刘同刚[11]等通过体外培养HepG2细胞，在不同治疗超声的声强、占空比和辐射时间作用下，观察pEGFP-N3质粒在HepG2细胞中的转染。在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在HepG2细胞中的表达，得出不同的超声转染参数对细胞活力和基因传输效率有较大影响，对其进行优化后可减少细胞损伤，增强基因转染。 1.3 绿色荧光蛋白GFP的荧光性质及优点 1.3.1 荧光性质稳定 绿色荧光蛋白GFP对光漂白（一种荧光衰减现象）有较强的耐受性，能耐受长时间的光照，从而延长了可探测的时间。GFP在pH7-12范围内能正常发光，对高温（70℃）、盐、有机溶剂、除垢剂和大多数普通酶都有较强的抗性[12]。 (责任编辑：qin) |