glgB/GASBD融合基因在马铃薯中的表达对淀粉分支程度的影响(3)
时间:2021-06-01 22:48 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
对转基因淀粉中glgB-GASBD或GASBD-glgB融合蛋白的积累量用Western斑点杂交方法进行分析。首先取20mg转基因淀粉,加入200μL 2×SDS样品缓冲液,煮沸5分钟,然后待温度降至室温后,最后用Mini Trans-Blot System (Bio-Rad,美国) 将转基因淀粉凝胶中的glgB-GASBD或GASBD-glgB蛋白印迹转移到硝酸纤维素膜上(Milliper公司,美国)。电转移条件是:200mA,4℃,120min。将转印后的硝酸纤维素膜置于80mL封闭液中[80mL TTBS缓冲液(TBS+ 0.05% Tween-20)+5%脱脂奶粉+0.1% BSA],室温下封闭过夜,然后用10mL TTBS缓冲液洗膜4次,每次10min,接下来适当的加入用TBS(20mMTriss-HCl,500mMNaCl,pH7.5)缓冲液1:500稀释的一抗Anti-GASBD,室温下温育2h,接着用TTBS缓冲液洗膜3次(每次5min)后,加入用TBS缓冲液1:500稀释的二抗(优尔根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG,IgG-HRP,KeyGEN,南京),室温下温育2h。最后用TBS缓冲液清洗3次,每次5min。最后用显色液(10mL 0.05M Tris-HCl,0.01mL 30% H2O2,6mg 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸,pH 7.6)显色2-3min。注意在实验过程中每个样品重复检测3次。 (责任编辑:qin) |