能和Taq DNA聚合酶作用的蛋白质的筛选(3)
时间:2017-05-25 17:09 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
Taq DNA聚合酶具有5′→3′核酸外切酶活性，但没有3′→5′核酸外切酶活性，因此不具有3′→5′的校对活性。其错配率取决于dNTPs的浓度，会在PCR反应的3′末端加上额外的非模板链的核苷酸，通常为dATP。因此由Taq DNA聚合酶参与的PCR产物可以直接克隆到含有3′-T突出端的载体上。 1.3、热启动 在聚合酶链反应中先将模板同引物在高于两者变性温度的条件下处理一段时间，然后再加入酶和其他成分进行扩增反应，用以消除非特异性扩增产物的方式在聚合酶链反应(PCR)中先将模板同引物在高于两者变性温度的条件下处理一段时间，然后再加入酶和其他成分进行扩增反应，用以消除非特异性扩增产物的方式。更好的PCR热启动方式是PCR反应混合物中含有抗DNA聚合酶的抗体，只有当热(一般到90℃以上)使抗体失活后，才能进入PCR扩增的热循环。 1.4常用蛋白标签 His-tag是蛋白纯化的标签His-tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，包括Ca2+、Mg2+、Ni2+、Co2+等，其中以镍离子使用最为广泛。镍琼脂糖凝胶FF的配基是最经典的IDA，镍离子有优尔个螯合价位，Ni-IDA螯合了三价，剩余三价，而Ni-NTA螯合了四价的，剩余是两价。因此，Ni-IDA琼脂糖凝胶作用力要比Ni-NTA琼脂糖凝胶的强。也正因为这个原因，IDA的载量要比NTA高，而在同样条件下Ni-IDA洗杂质和目标蛋白的要比Ni-NTA的咪唑浓度高。但是NTA的填料更稳定，能耐受更强的还原剂，更不容易脱落。 Avi-tag——15个氨基酸残基组成的短肽标签Avi-tag是一个由15个氨基酸残基组成的短肽标签，在体内或体外都能被生物素连接酶在赖氨酸残基连接上一个生物素，从而实现蛋白的生物素化。而抗生物素蛋白或链霉亲和素可以专一地与生物素结合，正是基于这两个反应，Avi-tag技术可以应用于蛋白的固定、纯化和显影等。借助Avi-tag和生物素连接酶，基本上所有的蛋白质都能被有效的、特异性地标记上生物素标签。在体外试验中，BirA酶标记生物素的效率超过了95%。多功能复合标签蛋白标签是生命科学研究、产品开发等必不可少的工具。每种蛋白标签都有其适用的适用范围，通过不同标签之间的有效组合就能大大拓展蛋白标签的应用。例如His-Tag很适合蛋白纯化，但不能提高融合蛋白在E.coli中表达的可溶性，而将TrxTM、SUMO可以促进重组蛋白可溶性的标签与His-Tag一起组合，就可达到即提高可溶性重组蛋白表达，有便于纯化的效果，在获得纯化蛋白后，还可以通过SUMO蛋白酶高效地把蛋白标签去除。 1.5、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis）是分子克隆的核心技术之一，琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、缓冲液浓度、电压、电流大小等），形状不同、大小不等和构象各异的DNA分子有不同的迁移率，所以可通过琼脂糖凝胶电泳使各种DNA分子分离。电泳结束后，荧光染料溴化乙锭（EB）可与凝胶中的DNA结合，在紫外照射下可显示荧光条带，据此进行实验结果的分析。在不同浓度的琼脂糖凝胶中相同大小的DNA片段的迁移率是不同的，并且，在相同浓度的琼脂糖凝胶中，大小不同的DNA片段的迁移率也不相同。 (责任编辑：qin) |