常州市售克氏原螯虾遗传多样性分析(2)

1.1 国外研究状况

2 材料和方法

2.1 材料

本次研究共在常州水产批发市场采集了3个克氏原螯虾群体各20尾样本，通过向销售人员询问了解群体来源4分别为湖北（HB）、山东（SD）和河南（HN）。

2.2 主要仪器设备及试剂

2.2.1 主要仪器设备

（1）移液枪 eppendorf 规格：100-1000µl、20-200µl、0.1-2µl

（2）高速台式冷冻离心机 TGL-16gR

（3）电热恒温鼓风干燥箱 OHG-9143B5-Ш

（4）脱色摇床 STS-3

（5）离心管 1.5ml

（7）PCR仪T100

（8）微型离心机 Mini-7K

（9）漩涡混合器 ORTEX-5 VORTEX-5

（10）微量紫外分光光度计 NanoDRop2000C

（11）电泳仪 DYY-6C型

（12）凝胶成像系统 Gel Doc EZ

2.2.2 主要实验试剂

抽提缓冲液、蛋白酶K、无水乙醇、酚、氯仿（三氯甲烷）、异戊醇、TE缓冲液（抽提缓冲液、TE缓冲液配制后需灭菌）、70%乙醇、-20℃预冷无水乙醇、Acr(丙烯酰胺)、5×TBE、AP（过硫酸铵）、TEMED、EB（溴化乙锭))

2.3 微卫星引物

本研究根据发表于GenBank上的克氏原螯虾微卫星引物序列，选用了4对引物用于此次研究。

座位引物序列退火温度重复类型片段大小 Genbank号

PclG-04 F:TATATCAGTCAATCTGTCCAG

R:TCAGTAAGTAGATTGATAGAAGG 54 (TCTA)3…(TCTA)2…(TCTA)29… (TCTA)2 170–290 AF290921

PclG-07 F:CCTCCCACCAGGGTTATCTATTCA

R:GTGGGTGTGGCGCTCTTGTT 63 (TCTA)8 100–160 AF290922

PclG-13 F:CTCTCCTGGCGCTGTTATTTAGC

R:TGAAGAGGCAGAGTGAGGATTCTC 62 (TCTA)12 130–150 AF290926

PclG-17 F:GTCGGGAACCTATTTACAGTGTAT

R:AAGAGCGAAGAAAGAGATAAAGAT 57 (TCTA)14 156–190 AF290929

2.4 DNA提取文献综述

采用苯酚-氯仿抽提法提取克氏原螯虾基因组总DNA，步骤为：

（1）用洁净的镊子取固定于无水乙醇的鳍条或肌肉组织100-200mg（约指甲盖大小）放入2mg灭菌离心管中，用洁净手术剪刀将其剪碎，剪碎后晾干使酒精挥发，注意每剪完一个样品，剪下一个之前将镊子和剪刀在蒸馏水中漂洗，然后用酒精棉擦拭以防样品污染。

（2）用移液枪向离心管中加入500-800uL抽提缓冲液及2.5 uL(1mg/mL)蛋白酶K（根据样品量确定加入抽提液体积），置于55℃烘箱或水浴锅中消化反应4-5小时或消化反应过夜（开始进行消化反应的半小时每隔5分钟翻转样品管，使成团组织块分散），消化至样品管内看不到组织碎块完全成为液体。

（3）从水浴锅或烘箱中取出消化好的样品，室温下放置冷却至室温。

（4）向离心管中加入等体积的平衡酚（抽提缓冲液：平衡酚=1：1，平衡酚PH=8.0）。 (责任编辑：qin)