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本研究选定拟南芥植株这种模式生物，采用Col-0野生型和ann1、dnd1两种钙通道蛋白突变体作为实验材料，利用非损伤微测技术测定褪黑素对其根细胞Ca2+运输的影响，进而研褪黑素对钙信号的作用机制，推测褪黑素在调控植物抗逆性中的机制。这将为未来进一步深入研究褪黑素和细胞质钙信号相互作用调控植物抗逆性奠定了良好的基础。

2材料与方法

2.1 供试材料：

2.1.1实验材料：

拟南芥种子：野生型Col-0和Annexin1蛋白突变体ann1、CNGC2突变体dnd1，3个供试拟南芥种子均来自剑桥大学植物科学系Julia Davies实验室。

2.1.2培养基与试剂

MS培养基（g/L）：MS1.76g，植物凝胶6.4g，H2O 800ml，pH 5.6；

种子杀菌溶液：10%次氯酸钠，0.05%Triton X=100；

70%酒精溶液；

钙离子测试液：0.1 mM NaCl, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 0.5 mM KCl, pH 5.7）。

2.1.3仪器    

VD-650型桌上式洁净工作台      上海苏净实业有限公司

PHS-3C 精密PH计 上海雷磁仪器厂

DK-S24型电热恒温水浴锅    上海一恒科学仪器有限公司

S10-2型恒温磁力搅拌器      上海司乐仪器有限公司

LRH-250-GS人工气候箱 广东省医疗器械厂

非损伤微测系统(NMT-100-SIM- YG) 北京旭月科技有限公司

2.2实验方法

2.2.1 拟南芥种子培育与处理

拟南芥种子的培育：

(1) 实验开始进行前：超净工作台先经紫外线照射10min；

(2) 取约10粒Col-0拟南芥种子放入离心管；

(3) 在离心管中加入1mL70%浓度酒精消毒45s后，将酒精弃去；

(4) 加入1mL无菌水冲洗，振荡1min后弃去无菌水；

(5) 加入1mL杀菌溶液振荡1min，静置4min后弃去杀菌溶液；

(6) 用1mL无菌水冲洗,弃去，反复冲洗5次；

(7) 之后加入0.1mL无菌水，吸取种子置于MS培养基，放入气候箱培养一周至长出根系；

(8) ann1、dnd1两种突变体同上进行培育。

2.2.2 非损伤微测技术来,自|优;尔`论^文/网www.youerw.com A

本实验采用非损伤微测技术测定跨膜钙离子流的变化，技术详细描述参考文献[17]。

2.2.2.1 电极制备

对应Ca2+选用相应的电解液，从后部灌充相应的电解液，等至电极尖端溢满电解液，再将液态离子交换剂（LIX）灌入电极，电极制备完成。本部分实验所使用到的离子选择性微电极灌充液和LIX信息如下：

Ca electrode, 100 mM CaCl2，LIX 21048, LIX Fluka。