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有新基因，产生新产物，具有新功能用途，本研究将为后续植物内生放线菌功能的深入研究提供新菌株。

2材料与方法

2.1材料

2.1.1实验菌株

菌株KLBMP 5180为从中华补血草中分离得到的植物内生菌。

2.2实验仪器

洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；恒温培养箱，烘箱（上海精宏实验设备有限公司）；高压灭菌锅（SANYO Autoclave MLS-3020型）；BIOTEK酶标仪（美国 ABI Beriti 96型）；PCR仪（Bio-RAD）；超纯水制备系统RCT-3200A（艾科浦公司）；紫外分光光度计（XIN MAO UV-7504型）；电子分析天平（Sartorius BSA224S Max 220g型）；低速离心机（长沙湘仪仪器有限公司）；制冰机SIM-F124（日本三洋公司)。

2.3形态和培养特征

2.3.1形态观察

用埋片法观察形态：

在ISP 2琼脂平板中间挖出一个1×2cm的长方形，然后在长方形边缘接种，最后盖上无菌盖玻片。培养7天后取出盖玻片，喷金后用扫描电镜观察。

2.3.2培养特征

将菌株接种在放线菌培养专用培养上，在培养第7d、14d观察记录生长情况，与标准色卡比较，记录菌落及菌丝颜色。

2.4生理生化特征

2.4.1pH耐受实验

将菌株分别置于pH4.0~10.0的液体培养基中，在28oC培养7-14天，记录菌株的生长情况，以确定菌株生长的pH范围和最适pH值。

2.4.2温度耐受实验

  使用ISP 2固体培养基，将菌株置于0~45oC不同温度环境下，记录菌株的生长情况，以确定菌株生长的温度范围和最适生长温度。

2.4.3NaCl耐受实验文献综述

  将供试菌株分别置于0~15%不同浓度NaCl培养液中，观察菌株是否生长并记录其生长情况，以确定菌株可耐受的NaCl浓度范围和最适NaCl浓度。

2.4.5碳源利用实验

  先将供试菌接到基础培养基中，然后按0.1~0.2%的浓度把不同碳源加入基础培养基。培养2周后，比较加碳源与不加碳源的基础培养基上菌株的生长情况。

2.4.6氮源利用实验

  先将供试菌接到基础培养基中，然后按照0.5%的浓度把不同氮源加入基础培养基。培养2周后，比较加氮源与不加氮源的基础培养基上菌株的生长情况。

 2.4.7酶学特性实验

  包括过氧化氢酶酶、接触酶、脲酶、酯酶、明胶液化、淀粉水解、牛奶凝固与胨化、纤维素水解、硝酸盐还原、是否产H2S等。

2.5化学分类特征

2.5.1菌体的培养与收获

 用ISP 2液体培养基于摇床震荡培养，通过离心收集菌体，用蒸馏水洗涤二次，并抽真空冻干，将干菌体置于4oC冰箱中保存。

2.5.2磷酸类脂分析

  磷脂的提取采取氯仿/甲醇法，磷脂组分分析方法按照Jones[19]的方法进行。

2.5.3醌组分分析

  醌组分的提取参照Collins[20]的方法，用高效液相色谱（HPLC）[21]来分析醌型。

2.6分子分类

2.6.1 DNA的提取

采用溶菌酶-SDS裂解法来提取基因组总DNA，提取后加约30-50μL 无菌水溶解DNA,并放入4oC或-20oC备用。

菌株16S rRNA基因的PCR扩增:

(1) PCR扩增引物为通用引物对，序列为：

正向引物PA：5’-CAG AGT TTG ATC CTG GCT-3’

反向引物PB：5’-AGG AGG TGA TCC AGC CGC-3’

(2) PCR反应体系为：10×Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture (10 mM each) 1 μL，Taq 酶 (5 U/μL) 0.5μL，MgCl2 (25 mM)3μL，引物（10 nmol/L）各1μL，模版DNA 2μL，用ddH2O补充至50μL。

(3) PCR反应条件为：95 oC5 min → 95 oC1 min → 55 oC1 min → 72 oC3 min (循环30次) → 最后72 oC延伸10 min。 (责任编辑：qin)