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1  材料与试剂

1.1  取样

2015年12月选定学校池塘6个采样点进行采样，到2016年5月份再在同样的6个点进行采样，每次采样都在上午十点左右。在六个采样点分别取300 ml池塘水，灌于棕色瓶内。为了防止酸化引起的色素溶解，在300 ml水样加入0.3 ml 1 %的碳酸镁悬浊液。并用微孔滤膜过滤水样[16]。

1.2  主要仪器与试剂

可见分光光度计、抽滤器、微孔滤膜、低温冰箱、离心机、离心管、镊子、比色皿、针式过滤器。1 %的碳酸镁悬浊液、90 %的丙酮溶液、0.1 mol/L的盐酸溶液。

2  干扰及消除

脱镁叶绿素a在接近叶绿素a的波长上亦有吸收，把脱镁叶绿素a与叶绿素a的混合物用0.1 mol/L的盐酸溶液酸化，由于镁原子损失，脱镁叶绿素a降解为脱镁叶绿素a，纯脱镁叶绿素a不发生变化，根据酸化前的纯叶绿素a与酸化后的脱镁叶绿素a吸收峰之比，对表现叶绿素a的浓度作脱镁叶绿素a的校正，从而得到纯叶绿素a的含量[17] 。

3  分析步骤

3.1  抽滤

将装置连接到真空泵的抽滤器上，加入300 ml的水样，进行减压抽滤，水样刚刚通过微孔滤膜时停止抽滤，使用镊子将滤膜对折，吸干水分，最后放入棕色小瓶中。

3.2  反复冻融法提取

将放有过滤后的微孔滤膜的六个棕色瓶于-80℃冰箱中冰冻20 min，由于过低的温度使细胞质产生冰粒，导致细胞质体变形，细胞壁破裂，达到了破碎细胞的目的。然后在室温条件下避光解冻10 min，使叶绿素等内含物溶出，此过程反复三次[18] 。三次反复冻融之后，向每个棕色小瓶中加入10 ml 90 %丙酮溶液，首先盖紧塞帽剧烈摇震片刻，接着放置于4℃冰箱中避光浸泡4-12 h，期间摇震2-3次。来!自-优.尔,论:文+网www.youerw.com

3.2.1  反复冻融法的注意事项

由于反复冻融法是利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度的增高引起溶胀来破碎细胞．因此抽滤后的滤膜应保留少许水分，防止藻细胞失水。

3.3  离心

将棕色小瓶中的提取液倒入离心管中，放入离心机，以3500 r/min的速度离心15 min。

3.4  测定

将离心后的上清液倒入1×1 cm比色皿中，用90 ％丙酮溶液作对照，分别测定波长为750 nm，664 nm，647 nm和630 nm处的吸光度值，当含有脱镁叶绿素a时，应测定脱镁叶绿素a的含量。具体做法是：在装有上清液的比色皿内滴加0.1 mol/L 40 μl的盐酸溶液，酸化20 min后分别测定750 nm，665 nm波长处的吸光度值。根据叶绿素波长的吸收，通过公式计算出叶绿素的含量[17] 。