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稀释后浓度（mg/ml） 0.45 0.37 0.41

样品稀释倍数 10倍 10倍 10倍

样品原浓度（mg/ml） 4.55 3.68 4.14

2.4.3  蛋白酶解（Filter Aided Sample Preparation,FASP）

小型仪器:

涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901）

离心机（Thermo,型号：PICO17）

恒温孵浴池（上海浦东荣丰科学仪器有限公司，型号：HH.S4）

所需的试剂及耗材:文献综述

DTT（Bio-Rad，货号：161-0611，美国）

碘乙酰胺（Bio-Rad，货号：163-2109，美国）

iTRAQ试剂盒中的Dissolution Buffer(AB Sciex,PN:4381664)

胰酶（Promega,货号：V5111，美国）

10 K超滤管（milipore,PN:UFC5010BK）

实验步骤:

1、蛋白定量后取200 μg蛋白溶液置于离心管中。

2、加入终浓度25 mM DTT,60度反应1 h。

3、加入终浓度50 mM 碘乙酰胺，室温10 min。

4、将还原烷基化后的蛋白溶液加入10 K的超滤管中，12,000 rpm 离心20 min，弃掉收集管底部溶液。

5、加入iTRAQ试剂盒中的Dissolution Buffer 100 μl，12,000 rpm 离心20 min，弃掉收集管底部溶液，重复3次（为节省试剂，这步可以将Dissolution Buffer用水稀释5倍后使用）。

    6、更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4 μg（与蛋白质量比1:50），体积50 μl，37℃反应过夜。

    7、次日，12,000 rpm 离心20 min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部。

    8、在超滤管中加入50 μl Dissolution Buffer，12,000 rpm 再次离心20 min，与上步合并，收集管底部共得到100 μl酶解后的样品。

2.4.4  iTQRAQ标记

小型仪器:

涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901）

离心机（Thermo，型号：PICO17）

真空冷冻干燥机（Thermo，型号：SPD2010-230）

所需的试剂及耗材：

8标iTRAQ ® 试剂盒（AB Sciex，PN：4390812，PN：4381664）

Ziptip（Millipore，PN：ZTC18M096（2μg））来!自-优.尔,论:文+网www.youerw.com

实验步骤:

1、从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ ® 试剂离心至管底。

2、向每管iTRAQ®试剂中加入150 μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底。

3、取50 μl样品（100 μg酶解产物）转移到新的离心管中。

4、将iTRAQ试剂填加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2小时。

5、加入100 μl水终止反应。

6、为了检测标记效率及定量准确性，从4组样品中各取出1 ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF（AB SCIEX 4800 Plus）鉴定，确认标记反应良好。

7、混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底。

8、真空冷冻离心干燥。

9、抽干后的样品冷冻保存待用。