TSC1基因在徐淮山羊胎羊组织表达差异研究(3)
时间:2021-09-03 19:11 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
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上述研究结果证明TSC1基因在动物肌肉发育中有一定作用，但有关TSC1基因在徐淮山羊组织表达情况还没有报道，本实验采用荧光定量PCR的方法检测TSC1基因在徐淮山羊胎羊八个组织中的表达量并测出相对表达量，采用spss19.0软件分析相对表达量的差异显著性，为预测和研究TSC1基因的功能即调控细胞生长等生理过程和维持山羊器官的结构、功能稳定方面提供前期实验依据。 2材料和方法 2.1实验步骤 采集山羊组织→提取总RNA→反转录成cDNA→PCR定量→数据分析→撰写论文 2.2实验材料 2.2.1样品来源 实验所用样品采自徐淮山羊的器官组织，将心、肝、脾、肺、肾、肠、背肌、腿肌等部位组织各采集三份，洗净后迅速放到液氮中，带回实验室保存在-80℃冰箱中。 2.2.2试剂文献综述 液氮、RNAiosplus（裂解液）、氯仿、无水乙醇、异丙醇、75％乙醇、RNase-free水、Taq酶、琼脂糖、TBE缓冲液、核酸染料、SYBR荧光染料、PCR试剂盒、反转录试剂盒:① gDNA Eraser ② 5xgDNA Eraser Buffer ③ Prime Script R-T Enzyne Mix1 ④ 5xPrime Script Buffer 2(for Real Time) ⑤ RT Prime Mix ⑥ RNase Free dH2O ⑦ EASY Dilution (for Real Time PCR) 2.2.3仪器 实验中使用到的仪器见表2-1 2.3实验方法 2.3.1样品RNA的提取[5] 实验室已为我们提供了徐淮山羊八个组织的材料，分别为心、肝、脾、肺、肾、肠、背肌、腿肌等，保存在-80℃的冰箱中，可直接进行总RNA的提取，其步骤如下： 表2-1 实验仪器与设备 Table2-1 Experimental apparatus and equipment 仪器名称 型号 生产厂家或地址 高速冷冻离心机 超净工作台 电热恒温水浴锅 Eppendorf移液器系列 紫外分光光度计 超低温立式冰柜 掌上离心机 电子天平 制冰机 PCR仪 微波炉 荧光定量PCR仪 台式高速离心机 电泳仪 普通冰箱 3-18K SW-CJ-1B 21-6 200μL，100μL，20μL，10μL NANODROP 2000C MDF-382E WTL BP211D FM70A GeneAmp® PCR System 9700 WD700 CFX96 1-13 DYY-12型 BCD-257SL SIGMA公司 苏州 江苏常熟 德国 GBC公司 日本三洋 中国 德国Sartorious 中国格兰特 美国应用生物系统公司 佛山格兰仕公司 美国Bio-Rad公司 SIGMA公司 北京六一 海尔 （1）将剪刀、镊子、研钵等工具蘸上酒精并点燃杀菌，用实验托盘称取适量的样品加入冷却的研钵中并不断加入液氮进行研磨，直至粉末状。 （2）往研钵中加入1mL裂解液，盖上锡箔纸静置几分钟。 （3）将研钵中样品转移到离心管中称重配平，在高速低温离心机中离心（12000r/min,4℃)5min。 （4）把离心管取出来，将其中的上清液转移到新的Ep管中，加入0.2mL氯仿摇晃15s，在冰盒中静置5min，离心16min（条件同上）。 （5）从离心机中轻拿出离心管，吸出上清液加到新的EP管，加入等体积的异丙醇，摇匀后23℃水浴10min，再离心10min。 （6）离心完能看到白色沉淀，弃上清液，将沉淀留用，加入1mL75％的乙醇，摇晃荡涤管壁，再离心5分钟，弃上清液留沉淀，室温下干燥沉淀。 (责任编辑：qin) |