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2 材料与方法

2。1 材料

2。1。1 菌株

于茶卡盐湖采集水样，置于4℃冰箱密封保存。样品经过逐级梯度稀释后，用涂布法和四区划线法分离纯化，得到纯种菌株。

2。1。2 主要试剂与仪器

 琼脂粉、柠檬酸三钠（天津市福晨化学试剂厂）、细菌蛋白胨、酵母粉、KCl、MgSO4·7H2O（国药集团化学试剂有限公司）和NaCl（国药集团化学试剂有限公司）等；细菌DNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（上海生工生物有限公司）和引物合成（徐州乐康生物科技有限公司）；Tag DNA聚合酶、d NTP（徐州塞恩试剂有限公司公司）；PI染料（北京索莱宝科技有限公司）、电子天平（MP2002，上海恒平科学仪器有限公司）；小型高速台式离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂）；PCR仪（TC-25/H，Bioer Technology 公司）；无菌操作台（苏州净化设备有限公司）；显微镜；高温灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；恒温摇床（太仓市实验设备厂）；恒温培养箱（DHP-9052，上海一恒科技有限公司）；UV7540紫外分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；凝胶成像分析系统(上海欧翔科学仪器有限公司)、流式细胞仪（美国BD 公司）；电泳仪。

2。1。3 培养基

液体培养基（PH=7。5-8。0）：酵母膏10g，蛋白胨7。5g，柠檬酸三钠3g，NaCl 100g（盐量可变），KCl 2g，MgSO4·7H2O 10g，去离子水1000ml。固体培养基加琼脂粉20g。高压灭菌锅121℃灭菌20 min，备用。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

2。2 方法

2。2。1 菌株的分离筛选

菌株的分离与富集培养采用嗜盐细菌培养基。将采集的水样按1 : 100的比例稀释后直接加到液体培养基中，放入摇床，设置摇床参数，转速为200 r/min，温度为37 ℃，恒温振荡培养2d。取上述培养液10µL，按照1：1000的倍数稀释，采用涂布法接种于平板，置于37℃的恒温培养箱中培养36 h，再依据菌落的形态特征（颜色、大小、形状等），挑取单菌落进行反复划线培养，镜检，直至纯化。将最后一次挑取的单菌落接种至斜面，放置于4℃的冰箱中，保存菌种。

2。2。2 菌落与菌体特征

将分离纯化出的嗜盐细菌菌株采用四区划线法接种于嗜盐细菌固体培养基上，放置于37 ℃的恒温培养箱中培养36 h，观察嗜盐细菌单菌落的形态特征。

对分离纯化出的嗜盐细菌进行革兰氏染色，用显微镜观察菌体形状、大小、革兰氏染色反应等。

2。2。3 总DNA的提取

按照北京索莱宝科技有限公司细菌基因组DNA 抽提试剂盒的说明抽提嗜盐细菌基因组的DNA。

2。2。4 菌体16S r DNA基因的PCR扩增

制备50µL PCR反应体系：PF27正向引物( 5µmol /L) 2µL；PR1492反向引物( 5µmol /L) 2µL；基因组DNA 1µL；2×Taq Mix 25µL；ddH2O 定容至50µL。进行PCR扩增所用引物为细菌通用引物:正向引物