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1。2 棉花育种的意义

植物的雄性不育是普遍存在的自然现象，之前没有得到有效的利用。1763年Kolreuter观察到雄性不育现象，后来多个品种和种间杂种发现的雄性不育现象[9]。为实验和生产上的雄性不育植株育种提供了良好的材料。特别是雄性不育系的出现，使得授粉等一些步骤得到了简化，省去了很多人力。我国在20世纪70年代开始在水稻中利用不育系育种的方法，并很快在多种作物的杂交育种中熟练地使用[10-12]。棉花雄性不育的研究开始得比较晚，目前主要分为细胞核不育系，核质互作型不育系，生态敏感型不育系三种类型[13]。在生产上利用杂种优势制种主要采用的是核质互作型不育系。宇文璞等人发现了低温敏感不育系，通过控制温度选择不育和可育的应用，简化了育种的过程，并容易筛选出优势品种。为了能够快速获得育种所需的不育系类型，而且随着分子生物学和细胞生物学的发展，植物雄性不育的机制也在不断被挖掘。一些不育系的生理结构剖析[14-15]揭示了雄性不育的形态学特征,所以不育系在育种研究和生产中的作用是很大的。

随着拟南芥、水稻等全基因组测序的完成,以及蛋白组学和DNA基因芯片技术的应用, 越来越多与雄性育性相关基因被克隆、鉴定。植物细胞雄性不育的机理研究也由描述性和细胞水平逐渐深入到分子水平。但是,现有的机理研究仍然存在着一些未知领域,相信随着研究的不断深入,雄性不育的分子机理将会被了解得更加全面、彻底[16]。

植物生长素在棉花育种中有着重要的调控作用[17-18]，植物生长素的运输影响着棉花的育性[19] 。在前期实验我们通过AFLP来探究MS1突变体雄性不育产生相关基因，筛选到了与育性相关的表达差异基因，从差异基因中选取其中的一个目的基因作为研究的对象，进行详细的分析。

2。研究方法

2。1 cDNA-AFLP

     cDNA-AFLP技术是研究基因表达的一项新技术，其优点是重复性好、稳定、可靠，能对生物体转录组进行全面系统的分析，在基因表达特性研究、植物遗传标记分析和分离植物基因等方面广泛应用。本实验通过 cDNA-AFLP 技术方法对背景植株C312和MS1突变体花器官进行表达差异基因的筛选。从差异基因中筛选出目的基因来作为研究对象从而来探究MS1突变体雄性不育产生的相关基因。

（1）棉花总RNA的提取：依据植物多糖多酚总RNA提取试剂盒（天根）的说明步骤进行棉花组织总RNA的提取。

  ①取新鲜的棉花C312以及MS1的雄蕊和柱头，并快速至于液氮中，然后将组织至于冷处理过的研钵中，加入液氮快速将组织磨成粉末。

  ②取50mg组织粉末放入RNA-free离心管中，先加入475μl SL裂解液，再快速加入25μl的巯基乙醇，并充分震荡摇匀。

  ③按照试剂盒说明书的步骤进行总RNA的提取。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

  ④对已溶解到RNAase-FreeddH2O中的 RNA 进行浓度测定。

  ⑤用RNAase-Free枪头吸1μl 10loading buffer 和1μl 已溶解的RNA补足到10μl体系中进行琼脂糖凝胶电泳的检测。根据浓度的测量和电泳条带的分析对 RNA 质量进行评估。

(2)利用试剂盒将上述已提取的总RNA反转录成cDNA，构建C312以及MS1雄蕊和柱头的cDNA库。

(3)cDNA双酶切和连接

采用限制性内切酶 EcoRI和MseI进行双酶切和接头连接酶切体系：cDNA（1ug/ul) 1ul；EcoRI(10u/ul) 1ul；MseI(10u/ul) 1ul；10×Tango 4ul； ddH2O 13ul；Total 20ul。