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15-20min，继续用冷冻离心机离心。来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

6。离心后最后一次取上清液于新离心管中，再加入2倍体积的-20℃预冷无水乙醇，立即上 下翻转混合至絮状DNA出现。

7。最后一次进行离心，后缓慢倒出酒精至酒精挥发完，再用70%的酒精洗两次，并根据DNA 沉淀量加入200ul-400ulTE缓冲液溶解DNA，置于摇床缓慢摇动12h以上促进DNA溶解。

8。最后使用NanoDrop 2000微量分光光度计检测浓度,-20℃保存备用。

2。2  EST-SSR 引物设计与合成

本研究是从转录组测序 EST 序列中利用 SSRHunter 软件查找三碱基至六碱基重复的微 卫星序列，重复次数设置在 7 次以上，然后将获得的微卫星序列进行引物设计，引物设计 采用相应设计软件 Primer5，设计引物时注意事项参照张新宇等[11]的引物设计技巧，引物 片段大小在 18-27bp，引物序列 GC 含量一般在 40%-60%，Tm 值控制在 40-60 度，产物片 段长度在 100bp-400bp 之间，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。