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ddH2O    17。75 µL

将温育之后的消化连接液稀释10倍，PCR扩增（20 µL），检测连接反应是否成功，其中，用于PCR反应的Mse I-N Primer的序列如下：

Mse I-N Primer（5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’ N表示A/G/C/T 中的任一碱基）  来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

稀释后的消化连接液      5 µL

10×PCR Buffer  2 µL

2。5 mM dNTPs 2µL

MseI-N Primer 1µL

Easy Taq 0。2µL

ddH2O  9。8µL

PCR循环体系为：94°C预变性5分钟，然后进入如下循环：94°C变性30秒，53°C复性1分钟，72°C延伸1分钟，循环次数为26。循环结束后在72°C延伸8分钟。最后4°C保持。用2 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确认是否得到大于200bp的DNA弥散带，出现则为连接成功,见图1。1。将连接液用清洁试剂盒纯化，纯化后的连接产物置于-20°C冻存备用。