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2。2、方法

  2。2。1、细胞培养

小鼠乳腺上皮细胞系HC11 是由黄行许教授提供的（上海科学技术大学）[26]。细胞在37°C，5%的二氧化碳条件下，在RPMI 1640培养基中生长直到汇合，培养基含2 mM L-谷氨酰胺，10%的胎牛血清(FBS, Thermal, USA），10 ng/ml EGF和5 µg/ml的胰岛素。

诱导β-酪蛋白合成，细胞在RPMI 1640培养基中生长氨基酸补充不同的有10%马血清，5 μg/ml胰岛素，10 ng/ml EGF，1 µg/mL氢化可的松和1 µg/mL PR素。诱导培养基的处理是：完全RPMI 1640培养基（对照组），RPMI 1640培养基中只含有谷氨酰胺，和RPMI 1640培养基中只缺乏必需氨基酸。

  2。2。2、RNA干扰

用于RNA干扰实验，2。5×105细胞转染siRNA 5 nM，对照组的细胞用5 nM的非特异性siRNA转染（锐博生物科技，中国）。细胞在无抗生素培养基中和新鲜的诱导培养基进行体外培养直到汇合。siRNA序列F:CUGCCGGAGAACUAUAACGAA 和R:UUCGUUUGUUCUCCGGCGT1R1。转染24小时后，培养基改为诱导培养基，继续培养48h。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并收集所有提取的总核糖核酸和蛋白质。来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

  2。2。3、抑制剂处理

  在 RPMI 1640培养基中T1R1抑制或对照处理细胞，诱导β-酪蛋白的合成，维持48小时。 然后将细胞在37°C的厄尔平衡盐溶液（EBSS）培养15分钟，EBSS含有20 mmol/L 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-甲磺酸（HEPES，pH 7。4）辅以适当的浓度测试剂（GPNA 5 mM  / BCH 10 mM，或空白对照）。然后对照组是在诱导培养基添加不同的测试剂，孵育30 min细胞。细胞用PBS进行洗涤并且收集提取的总蛋白。

   2。2。4、实时定量RT-PCR

使用™PrimeScript RT试剂盒和DNaseI将RNA（1 µg）合成cDNA （Takara公司，大连，中国）。使用SYBR Green实时定量PCR系统进行mRNA水平半定量分析，选用小鼠氨基酮戊酸合成酶1（ALAS1）或肽基脯氨酸异构体（PPIA）作为内参。基因表达的定量分析是运用比较的方法进行ΔΔCT。