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50×TAE电泳缓冲液。Tris 242g，EDTA（0。5mol/L，pH8。0）100mL，冰乙酸57。1mL。将三者充分混匀后，用双蒸水定容至1000mL。

5mol/L NaOH 溶液。

Digestion Solution溶液。

1。2。2药品

琼脂条、琼脂粉、次氯酸钠、乙醇、异丙醇、葡萄糖、结晶紫、草酸铵、碘、碘化钾、番红、胰蛋白胨、酵母粉、NaOH、Digestion Solution、氯化钠、CTAB、Tris、EDTA（0。5mol/L，pH8。0）、冰乙酸、琼脂糖。

以上药品或试剂购买自国药集团化学试剂有限公司。

1。3培养基

1。3。1 PDA液体培养基

配制方法：称取200g去皮土豆，20g葡萄糖；量取1000mL蒸馏水；pH为自然。土豆去皮切成片状，加700mL蒸馏水煮至土豆发软即可，用八层纱布进行过滤后，留汁，加葡萄糖搅拌均匀后再加蒸馏水至1000mL，分装。最后在121℃下高压蒸汽灭菌20min即可。文献综述

1。3。2 PDA固体培养基

配制方法：同1。3。1配制方法，留汁加入17g琼脂条加热融化后，再加葡萄糖，以下步骤相同。

1。3。3 LB液体培养基

配制方法：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g；量取1000mL去离子水；5mol/L NaOH（调节pH）。将胰蛋白胨、酵母粉、NaCl和适量去离子水混匀，将pH调至7。0后用去离子水定容至1000mL，分装后，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

1。3。4 LB固体培养基

配制方法：同1。3。3配制方法，加入15g琼脂粉。灭菌后，取出培养基将其置于55℃恒温水浴，稳定后加入抗生素，充分摇匀后倒平板。倒完平板后，在超净台内打开紫外后把平板盖子打开照15min。再倒置放于4℃冰箱内冷藏保存。

1。4内生菌的分离

1。4。1植物样本的采集

所选植物样本均为新鲜植株，且生长状态良好、没有病斑或枯枝烂叶，植株要有叶子、叶柄和枝条以及其它部位。将植株的名称、采集地写在标签纸上并和植株一起拍照留存。若样本上有脏东西，用纸轻轻擦掉；若不知道植株的种类，将植株整个拍照留存，并做好相关记录。洗去采摘来的植株表面的灰尘污渍，去除枯枝烂叶，备用。

本实验植物样本均采自江苏南京。

1。4。2取样

在同一叶片的五个不同部位进行取样，剪取适当相同的大小。相同植株的相同部位接两块平板。计算好需处理的样本数，尽量多取一些样本，防止表面灭菌时样本被冲洗走。若植株没有用完，没有清洗过的装入采样袋后放入冰箱保存；反之，则扔掉。将所剪植株的所有部位放入同一个50mL的离心管（已灭菌）中，做好相应标记。

1。4。3表面灭菌来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

此步骤均在无菌操作台中进行。先向各量程为20mL离心管内倒入15mL 70%乙醇，拧紧盖子，灭菌1min，期间晃动离心管几次。1min后，小心的将乙醇倒入废液瓶中，不要带出样本，若样本掉出或除了离心管外的任何物体触碰过样本都不在使用此样本；再向各离心管中加满 3% 次氯酸钠，拧紧盖子，用计时器开始计时，期间几次离心管，10min后，拧松盖子，将次氯酸钠倒入废液瓶中；最后用无菌水冲洗样本三次，操作步骤同上步。

1。4。4平板接种

制作PDA固体培养基。倒平板，并待平板凝固后，在平板上标记编号，记为KW1233A（B、C、D……）01（02、03、04……），做好相应记录A（B、C、D……）为样本种类，01（02、03、04……）为取样部位