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2。2。2  重叠PCR连接cel3c与Pact（Pact - cel3c）

重叠PCR过程中，Pact的引物cel3c-Act-R设计时要比Xbal-F长，cel3c-Act-R设计时要比cel3c-R长，因为cel3c-Act-R引物上要有启动子相关序列，Xbal-F引物具有目的基因相关序列，在Xbal-F和cel3c-R的作用下，由于采用了具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼叠起来。

重叠PCR的方法为：取过柱回收的cel3c DNA 1L和Pact的DNA 2µL加入PCR体系中，加入Xbal-F、cel3c-R、T4DNA Ligase，将退火时间改为2min15s，其他均与启动子PCR体系程序相同。重复多次，将产物进行电泳，然后切胶回收。测其回收Pact-cel3c的DNA浓度。

2。2。3  Pact-cel3c-与载体（pCAMBIA-1300）的连接

1。 Pact-cel3c-的酶切

由于Pact-cel3c-的两端和pCAMBIA-1300上都含有XbaⅠ和HindⅢ的酶切位点，而且后面的克隆也要用到这两种酶，所以选择了XbaⅠ和HindⅢ这两种酶。用XbaI和HindⅢ这两种酶，将目的基因（包含启动子）切出粘性末端，以便于与载体连接。

根据说明书配置体系，体系体积根据酶切DNA的量决定。双酶切的Buffer选择根据说明书选择适合两种酶的Buffer，最后选择Tango buffer。酶切体系（40µL）：8 µL的H2O、4 µL的10×Tango buffer，27µL的cel1a-Pact，0。5µL的XbaⅠ，0。5µL 的HindⅢ。酶切步骤：将酶切体系放入37℃中水浴3h，之后琼脂糖电凝胶电泳。切胶回收，测量其浓度。

2。质粒的酶切

（1）质粒DNA的提取

实验前一天晚，挑取大肠杆菌单个菌落至LB培养基（卡那霉素浓度为100µg/ml），37℃振荡培养过夜（12-16h）。第二天将培养物加入至2ml 离心管中，离心，9000r,1min，弃清液。向沉淀中加入150LP1，移至旋涡混合仪上，直至沉淀溶解。加入150LP2，轻摇。加入150LP3，混合摇匀。离心，1300r，6min，吸取420L清液，加入1ml无水乙醇，再离心，1300r，6min。倒出液体，离心，1300r，1min，打开盖子，放入烘箱内，烘干10min。加入25L含有RNA酶的TER溶液，弹一下，离心，1300r，1min。置于30℃恒温箱中，10min。加入1mlSolution PB，吸取700l溶液，离心，8000r，30s，倒滤液，重复离心2次。加入洗涤缓冲液700L，离心，8000r，30s，倒滤液，重复离心2次。空离2min，晾2min。将制备管放在干净的1。5ml离心管中，在制备膜中央加50LTER，静置1min，9000r离心1min洗脱DNA。吸取管底的TER，再重复一次离心步骤。放在4°C冰箱备用。文献综述

（2）质粒DNA的酶切

用XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切，可与Pact-cel3c产生产生相同粘性末端，因此可以在连接体系中连接在一起。酶切体系（40µL）为：31µL的H2O、4 µL的10×buffer，4µL的质粒DNA，0。5µL的XbaI，0。5µL 的HindⅢ，酶切后电泳鉴定。然后进行切胶回收，测量回收DNA浓度。

3。 Pact-cel3c与pCAMBIA-1300的连接

连接体系（20 µL）为2。5µL H2O 、2µL的10×T4 DNA Ligase buffer、3µL的质粒载体、12 µL的目的片段 、0。5µL的 T4 DNA Ligase将上述体系置于22°C水浴锅中1h。

2。2。4  重组子导入大肠杆菌感受态细胞

将20µL连接体系、100µL大肠杆菌感受态细胞和30µLBuf，置于冰上30min。再转移到水浴锅中，42℃水浴80s，然后转到冰上2min。在无菌操作台中加入无抗生素的LB液体培养基 800µL于管中，37℃摇床1h后，7000rpm/min离心3min。移走上清800µL，用黄枪头重悬，混匀，最后涂平板。12-18小时后观察平板。

2。2。5 重组子的酶切