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摘 要：六六六是一种具有广谱毒性、高毒性和长残留性有机氯杀虫剂，在上世纪七十年代前世界范围内曾广泛使用，并对环境造成了严重的污染。目前已经报道了一些能够降解六六六的微生物，其中最具代表性且研究比较详细的菌株是从日本分离到的UT26。LinED是菌株UT26中降解六六六的关键基因之一，LinD在菌株降解六六六的代谢途径中负责催化使苯环上的氯除去，LinE在菌株降解六六六的代谢途径中负责催化使苯环打开。本文拟构建该基因的启动子与报告基因的融合表达载体，用以研究菌株在修复六六六污染土壤过程中该基因的表达情况。80052

毕业论文关键词：六六六，UT26，LinD，LinE，gfp

Abstract: Hexachloro-cyclohexane is a kind of organochlorine pesticides widely used around the world before the 1970s。 Due to its high toxicity and long persistent, it caused serious environmental pollution。 It has been reported that some microbes capable of degrading the hexachloro-cyclohexane, one of the most representative and study more detailed UT26 strain was isolated from Japan。 LinED were key genes in UT26 during it degrading  hexachloro-cyclohexane。 In the process of degradation hexachloro-cyclohexane, It is responsible for catalytic five and six step dechlorination and the ring cleavage。 This paper intends to construct the gene promoter and report gene fusion expression vector, to study the genes expression in strain during the process of the hexachloro-cyclohexane contaminated soil repairing。

Key words：hexachloro-cyclohexane, UT26, LinD, LinE, gfp

目  录

1 前言 3

2  材料与方法 4

2。1  供试菌株和质粒 4

2。2  试剂和溶液 5

2。3  实验仪器设备 5

3  实验过程与方法 6

3。1  大肠杆菌DH5α感受态细胞制备及转化 6

3。2  质粒提取 6

3。3  基因启动子区序列分析及引物合成 6

3。3。1 LinED启动子区相关序列 6

3。3。2  LinED启动子区与报告基因gfp重叠延伸： 6

3。3。3  引物设计 7

3。4  DNA片段PCR扩增 8

3。5  重叠延伸PCR 8

3。6  重组DNA片段PCR扩增 8

3。7  PCR产物TA克隆 8

3。8  重组DNA片段及载体限制性酶切及凝胶回收 8

3。9  融合表达载体构 9

4  结果与分析 9

4。1  PLinED与报告基因gfp的PCR扩增 9

4。2  PLinED与gfp的重组 9

4。3  重组DNA片段PLinED-gfp的TA克隆 10

4。4  重组广宿主载体P5-PLinED-gfp构建 11

参 考 文 献 14

致  谢 15

1 前言

六六六是上世纪七十年代前世界范围内曾广泛使用的一种有机氯杀虫剂，由于其高毒性和长残留性，造成了严重的环境污染，尤其一些生产企业关闭和搬迁后遗留的场地等高浓度的工业污染给当地带来严重危害，问题亟待解决。污染环境微生物原位修复具有高效、安全、成本低、无二次污染等优点，是有前途的修复污染方式。经过多年努力，微生物修复已在许多农药污染土壤的消除实践中取得了成功。微生物对污染环境修复的效果会受到诸如土壤的理化性质，污染物浓度、微生物的存活与定殖，降解基因的表达等一系列因素的影响。然而目前，对污染环境微生物原位修复机理的研究还不够透彻，尤其对于微生物原位修复过程中菌株生物学行为的研究还比较缺乏[1]。 (责任编辑：qin)