基于末端转移酶延伸放大的电化学DNA传感器设计(3)
时间:2017-06-17 17:13 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.2.1不经过修饰DNA的固定 目前DNA合成技术在合成长于50-mer修饰DNA方面仍有很大的困难，而且修饰合成DNA使成本成倍的增加。所以，在组装过程中，对于不修饰DNA在电极上的固定方法的研究是很有必要的，不修饰DNA主要是通过共价键和物理吸附两种方式固定在金电极上。 一、与金电极表面的共价键结合 DNA的5’和3’端分别存在着可以利用的磷酸基团和羟基基团，如图3。如果早金表面修饰能与这两种基团反应的功能性基团，如羧基、氨基、羟基等，通过化学反应将DNA共价固定在金表面。赵元弟【4】等用2-巯基乙醇处理金表面，通过巯基在金表面自组装形成外端为羟基的单分子层，在EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）存在下，dsDNA或ssDNA通过5’端经EDC活化的磷酸基团与羟基反应生成磷脂键固定在金表面上。他们用电化学方法和X射线光电子能谱分析（XPS）对DNA修饰表面进行表征，结果显示，在共价偶联活化剂作用下，DNA探针能和金电极表面的共价键结合，固定到金电极表面。 二、用物理方法固定 利用物理吸附的方法使DNA固定在金表面，是最简单的一种方法。Zhao等【5】将清洁的金表面直接用小牛胸腺DNA溶液处理，然后浸入水中除去未结合的dsDNA，就得到了dsDNA修饰的电极。固定ssDNA的方法相同，只是固定时间比dsDNA长4倍，且需在低温下处理。用循环伏安法对修饰电极进行表征，结果显示，dsDNA和ssDNA均成功的固定在金表面，dsDNA和ssDNA在金表面的固定密度相近，都是一种饱和吸附的单层。他们将两支dsDNA修饰电极分别用0.05mol/L H2SO4和0.1mol/L NaOH处理，结果显示，电极在酸中稳定，而在碱性环境中固定的DNA解吸附，电极的修饰层受到破坏。用沸水处理，绝大部分固定在电极表面的dsDNA和ssDNA脱落，说明修饰层对热不稳定。在电化学测定中，高电位可以使约2/3的ssDNA从电极上脱落，即修饰层在高电位不稳定，但电极在干燥环境中放置较长时间，对其电化学活性没有影响。由此说明，物理吸附的方法虽然简单，但由于没有经过化学键的固定，稳定性不是很高，而且其固定的原理和DNA在金表面的状态并不清楚，所以，物理吸附的方法还有待进一步的研究。 1.2.2 巯基修饰的DNA（HS-ssDNA）探针的固定 Au-S之间有很强的化学键合力（键能高达184KJ/mol）。如果将DNA用含硫化合物进行修饰（HS-ssDNA或-SS-ssDNA），利用金硫键的稳定，就可将DNA固定在金电极表面。金硫键非常牢固，将电极浸泡在缓冲液中24小时，也很难讲固定在金电极表面的探针出去。利用金硫键将DNA探针组装到金电极上的过程如图3。最常用的修饰剂是含1个硫原子的化合物（如6-巯基己烷），也有含2个硫原子的化合物。一般采用修饰探针直接处理金表面的，也有通过胶体金固定到的方法。利用金硫键进行DNA的固定是现在最常用的方法。 图3 利用金硫键将DNA组装在金电极上 汪红梅【6】等在一篇文献中提到了具体操作方法：（1）电极的预处理金电极（Φ=2 mm）。用 0.05 µm Al2O3 粉末和水的混合物打磨抛光至镜面，依次用无水乙醇、超纯水超声清洗。再将超声好的电极置于0.5 M H2SO4 中循环扫描至稳定。超纯水清洗，N2吹干后，马上进行探针 DNA的组装。（2）ssDNA/MCH/AuE的制备 。在金电极表面小心滴涂 3.5 µL 不同浓度的探针组装液，在 25℃、40%湿度的恒温恒湿箱中静置2小时， 以超纯水轻轻冲洗；在离心管中加入100 µL的1 mM 巯基乙醇（MCH）水溶液，将已组装上不同密度探针 DNA 的电极浸入其中，并以 封口膜密封，室温封闭 2 小时。（3）dsDNA/ MCH/AuE的制备 将组装好针的金电极浸入到 100 µL 含有固定浓度的互补序列杂交溶液中，在 38℃ 下杂交 1 h 后，超纯水轻轻清洗，在经氮气除氧后的离子浓度为50 µM 电解液中进行电化学测量，记录循环伏安和计时电量曲线。 (责任编辑：qin) |