AFLP分子标记鉴别江苏省稗草种的初步研究(2)
时间:2017-06-21 22:56 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.2 稗草种子培育过程 用稗草种子培育幼苗，分为5个阶段： （1）吸胀。为物理过程。种子浸于水中或落到潮湿的土壤中，其内的亲水性物质便吸引水分子，使种子体积迅速增大（有时可增大1倍以上）。吸胀开始时吸水较快，以后逐渐减慢。吸胀的结果使种皮变软或破裂，种皮对气体等的通透性增加，萌发开始。 （2）水合与酶的活化。这个阶段吸胀基本结束，种子细胞的细胞壁和原生质发生水合，原生质从凝胶状态转变为溶胶状态。各种酶开始活化，呼吸和代谢作用急剧增强。如大麦种子吸胀后，胚首先释放赤霉素并转移至糊粉层，在此诱导水解酶（α-淀粉酶、蛋白酶等）的合成。水解酶将胚乳中贮存的淀粉、蛋白质水解成可溶性物质（麦芽糖、葡萄糖、氨基酸等），并陆续转运到胚轴供胚生长的需要，由此而启动了一系列复杂的幼苗形态发生过程。 （3）细胞分裂和增大。这时吸水量又迅速增加，胚开始生长，种子内贮存的营养物质开始大量消耗。 （4）胚突破种皮。胚生长后体积增大，突破种皮而外露。大多数种子先出胚根，接着长出胚芽。 （5）长成幼苗。以后长出根、茎、叶，形成幼苗。 1.3 AFLP技术简介 1.3.1 AFLP技术定义 AFLP（Amlpified Fragment Length Ploymorphsim）是由荷兰科学家Zebeau发现，并由Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法。该技术于1993获得欧洲专利局专利（欧洲专利号EP 0534858A1），被Keygene公司以专利的形式将其买下，但不久予以解密。该方法是继RFLP（RestricitionFragment Length Ploymorphsim）、SSR（Simple Sequence Repeat）和RAPD（Random Amplified Polymorphsim DNA）之后发展最快的DNA指纹技术，是DNA指纹技术的重大突破，也是目前国际上最新最适用的DNA指纹技术[4-6]。 1.3.2 AFLP技术的原理 AFLP 技术是一项新的分子标记技术，其原理是：基因组DNA经过二种不同的限制性内切酶酶切后，产生粘性末端，再使用连接酶将人工合成的双链接头连接在酶切位点的粘性末端。接头一端具有与内切酶同样的识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板进行预扩增。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。引物包含选择性碱基，选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。另外，通过选择在末端分别添加了1～3个选择性核苷酸的不同引物，可以达到选择扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配对序列的内切酶酶切片段。并与之结合，实现特异性扩增。 进行AFLP 分析时, 一般应用2种限制性内切酶对基因组DNA进行酶切, 一种为低频剪切酶, 识别位点为优尔碱基的内切酶; 另一种为高频剪切酶, 识别位点为四碱基的内切酶。双酶切产生的DNA 片段长度一般小于500 bp, 在AFLP 反应中可被优先扩增, 扩增产物可被很好地分离, 因此一般多采用稀有切点限制性内切酶与多切点限制性内切酶相搭配使用的双酶切[8]。目前常用的2 种酶是4 个识别位点的Mse I和6个识别位点的EcoR I 。AFLP 接头和引物都是由人工合成的双链核苷酸序列。AFLP接头一般长14～18 个碱基对, 由1个核心序列和1 个酶专化序列组成。常用的多为EcoR I 和Mse I接头, 接头、与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点[9]。AFLP 引物包括3 部分:(1)5´端的核心碱基序列;(2)限制性内切酶特定序列;(3)3´端选择性碱基序列。由于引物的核心序列与接头部分相对应, 因此, 两者遵循相同的设计原则:(1) 限制性片段与对应的接头连接应保证原限制性内切酶位点不得恢复;(2)具有合适的G、C 含量, 一般G+ C 的含量大于50% ;(3)接头不进行磷酸化, 避免接头间自连接。 (责任编辑：qin) |