跳虫的宏条形码技术应用初探(3)

（1）每种各取一只跳虫加入到已灭菌的1。5ml离心管内，加入180μl Buffer ACL和20μl蛋白酶K，摇晃震荡，于56℃恒温水浴1h。期间，每隔半小时拿出离心管进行摇晃混匀，防止虫体贴在管壁；

（2）加入200μl Buffer CL，充分颠倒混匀。如产生沉淀，可于70℃水浴10min；

（3）加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀；

（4）将吸附柱放至收集管内，用移液枪将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加于吸附柱内，转移时，将样本表壳留在原1。5ml离心管内，加入适量75%酒精溶液，保存于-20°C冰箱中用于形态学研究。吸附柱静置2min后，以10,000 rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液；文献综述

（5）将吸附柱放回收集管内，向吸附柱中加入500μl CW1 Solution，以10,000 rpm室温离心30s，倒掉收集管中的废液；

（6）将吸附柱放回收集管内，向吸附柱中加入500μl CW2 Solution，以10,000 rpm室温离心30s，倒掉收集管中的废液；

（7）将吸附柱重新放回收集管内，以12,000 rpm室温离心2min，离去残留的CW2 Solution后，将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，晾干CW2 Solution，防止影响DNA产量和后续实验；

（8）取出吸附柱，放入一个新的1。5ml离心管内，加入50μl CE Buffer，静置3min后，以12,000rpm室温离心 2min，收集DNA溶液；

（9）将提取的DNA保存于-20℃冰箱中。

1．3．2 PCR扩增

（1）引物的选择，如表1所示：

表1 单样DNA PCR所用分子标记、引物、文献来源等信息

分子标记引物名称引物序列（5’→3’）长度（bp）文献来源

COI mlCOlintF-N504 AGAGTAGAGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC 34 [9]

jgHCO219-N706 TAGGCATGTANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA

（2）PCR扩增

本实验中的PCR反应体系为25μl，按下列组成进行配置：

Mix 12。5μl

上游引物 1。25μl

下游引物 1。25μl

ddH2O 8μl

DNA模板 2μl

将配置好的反应体系加入PCR管中，盖紧管口。在TC-5000（TECHNE）扩增仪上完成扩增。PCR反应程序如下：

94℃变性1min，先94℃保持40s，45℃退火40s，72℃延长1min，进行5个循环，再94℃保持40s，51℃退火40s，72℃延长1min，进行35个循环，在最后一个循环后，反应在72℃维持5min。

注意部分体型较小的虫体，若第一次扩增未能成功，可适当增加反应体系中的模版量（25μl体系中其他试剂量不变，减少ddH2O的量），以提高片段扩增成功的概率。来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-

1．3．3 电泳及常规测序

（1）称取0。4g琼脂糖加入至20ml 1*TAE中；

（2）于有机玻璃胶槽上插上样品梳；

（3）将配好的琼脂糖溶液放入微波炉中加热融解至溶液透明，无白色沉淀；

（4）待不烫手后，取0。2μl溴化乙锭(EB)溶液加入至琼脂糖溶液中；

（5）将琼脂糖倒入胶槽内，使溶液形成均匀的胶层，待胶完全凝固后拨出梳子；

（6）取5μl DNA扩增产物和3μl DNA marker，使用微量移液枪分别加入样品槽中；

（7）将样品槽放入电泳池中，接通电源。控制电压保持在80-100V，电流在90mA左右。电泳20分钟左右； (责任编辑：qin)