（1）IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）溶液：

在8 mL蒸馏水中溶解2 g IPTG后，用蒸馏水定容至10 mL，用0。22 μm滤器过滤除菌，分装成1 mL小份贮存于-20 ℃。

（2）考马斯亮蓝R-250染色液：

考马斯亮蓝R-250 1 g溶于250 mL异丙醇，加入100 mL冰醋酸。去离子水补足至1 L，滤纸除去颗粒物，室温保存。

（3）考马斯亮蓝G-250显色液：

考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 ml 95 %乙醇，加入 100 mL 85 %磷酸，用蒸馏水稀释到1000 mL，室温保存。

（4）1× PBS缓冲液：

8 g NaCl，0。2 g KCl，1。44 g Na2HPO4，0。24 g KH2PO4溶于800 mL蒸馏水，调节pH至7。4，双蒸水定容至1 L。

（5）脱色液：论文网

冰醋酸100 mL，乙醇50 mL，去离子水850 mL，充分混匀。

 （6）咪唑母液（1 M）：

6。808 g咪唑溶于100 mL去离子水，根据情况稀释使用。

（7）抗生素浓度及配制：

庆大霉素（50 mg/mL）：溶解500 mg硫酸庆大霉素于足量的去离子水中，最后定容至10ml，分装成小份于-20 ℃贮存。工作浓度40 μg/mL。

卡那霉素（10 mg/mL）：溶解100 mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10 ml，分装成小份于-20 ℃贮存。工作浓度50 μg/mL。

SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自Solarbio，5×蛋白上样缓冲液、低分子量Protein Marker购自TaKaRa，牛血清白蛋白及胰蛋白酶购自Sigma，ALP609多克隆抗体购自艾比玛特。 

1．4  仪器

   立式压力蒸汽灭菌锅、超净工作台、紫外分光光度计、电子天平、磁力加热搅拌器、全自动凝胶成像分析仪、冰箱、高速离心机、冷冻离心机、涡旋混合器、稳流稳压电泳仪、光学显微镜、恒温培养摇床、脱色摇床、微波炉、垂直电泳槽、超声波破碎仪、恒温水浴锅、生化培养箱

1．5  实验技术及方法

1．5．1  黏附相关蛋白的表达与纯化

（1）活化：取一支灭菌试管，向其中加入100 μL保藏的菌种和3 mL LB液体培养基，37 ℃恒温摇床过夜培养。

（2）扩大培养：按照菌液：培养基=1:100比例扩大培养，向300 mL培养基中加入100 μL卡那霉素，再加菌液混匀，相同条件下培养至OD600值0。6-0。8左右（约2。5 h）。

（3）诱导：向菌液中加入30 mL IPTG，27 ℃诱导3 h。

（4）收菌：将诱导后的菌液 分装至两个500 mL离心瓶中，5000 rpm离心10 min。弃掉上清，向其中一瓶加入10 mL Tris-HCl缓冲液吹打均匀，菌悬液移至另一瓶中，再次吹打均匀。

（5）破壁、收样：将菌液转移至塑料离心管中，用泡沫板固定置于盛有冰水的烧杯中，超声波破壁20 min（注意：塑料管需固定牢靠以防破碎时晃动从而损害仪器）。将破壁后的菌液转移到离心管中，13000 rpm离心15 min，上清-20 ℃保存。

（6）表达的蛋白样品中含有杂蛋白，为了后续实验的进行需对蛋白样品进行纯化。纯化前取出1 mL作为对照，余下样品用于纯化。本实验使用镍柱纯化，具体步骤如下：

①洗镍柱：先后加入300 mM咪唑和超纯水，体积分别为6倍和9倍柱床体积（6 ×V和9 ×V）。

②平衡：缓慢加入6 ×V 5 mM咪唑，平衡之后不要再动柱子。文献综述

③上样：蛋白样品经0。22 μm滤器过滤后，在4 ℃冰箱过柱子。

④除杂：梯度浓度咪唑（6 ×V）洗脱，浓度依次为5 mM、20 mM、50 mM，每个浓度分6次滴加，收集第一管和最后一管。

⑤纯化：300 mM咪唑（6 ×V）洗脱，分6次滴加，每管都收集。收集液再重复本步一次。

⑥后续处理：样品全部流出后，待电泳确认最后一管无明显蛋白时即可处理镍柱： 黏附相关蛋白ALP609在蜜蜂螺原体侵染宿主细胞过程中的作用研究(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_101999.html