Corallococcussp.EGB来源的麦芽糖淀粉酶AmyZ的基因克隆表达及其酶学性质研究(2)

2．4金属离子和常用化合物对重组酶AmyZ活性的影响 6

2。4。1金属离子对重组酶AmyZ活性的影响 6

2。4。2常用化合物对重组酶AmyZ活性的影响 7

2。5 AmyZ的底物特异性 7

2。6 重组酶AmyZ对不同底物的水解产物分析 8

3 讨论 8

致谢 9

Corallococcus sp。 EGB来源的麦芽糖淀粉酶AmyZ的基因克隆表达及其酶学性质研究麦芽糖α-淀粉酶(EC3。2。1。133，maltogenic α-amylase)，全称1,4-α-D-葡聚糖-α-麦芽糖基水解酶，是α-淀粉酶家族中作用于淀粉及相关多聚糖以麦芽糖单位从淀粉链的非还原末端按顺时针方向被水解，主产物为α-麦芽糖的一类酶，属于淀粉分解酶类GH13家族[1]。麦芽糖淀粉酶不但可快速水解利用直链淀粉或环状糊精，也能少量利用支链淀粉，具有多底物特性[2-3]。

麦芽糖浆在冷冻食品、烘焙、酿造和饮料工业的应用方面具有很高的商业价值，尤其是高纯度的麦芽糖在医药工业有着重要的用途。随着人们对麦芽糖质量要求的进一步提高，对具有重要工业应用价值的新型麦芽糖淀粉酶制剂的研究已成为热点[4-5]。国外对麦芽糖淀粉酶进行了大量的研究，几家大型酶制剂公司如诺维信、丹尼斯克等，已有麦芽糖淀粉酶面世，但价格昂贵。国内对麦芽糖淀粉酶的研究还处于初级阶段，因此国内目前使用的麦芽糖淀粉酶基本依赖进口。目前的麦芽糖生产是将淀粉通过真菌淀粉酶和β-淀粉酶处理, 产生由葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、四糖等麦芽低聚糖以及多糖组成的普通麦芽糖浆，再添加脱支酶和β-淀粉酶共同作用, 或用葡萄糖淀粉酶等对普通麦芽糖浆进行后处理得到高麦芽糖浆。由于生产过程中存在葡萄糖、麦芽三糖、四糖等低聚糖以及多糖等副产物, 严重影响其麦芽糖质量，且高浓度麦芽糖生产效率低，需要后期进一步工业纯化从而提高了生产成本[6-7]。因此，对新型麦芽糖淀粉酶的开发研究，对于降低高品质麦芽糖的成本，提高工业化生产水平具有十分重要的意义。文献综述

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌株与质粒

粘细菌、大肠杆菌DH5α、pMD19-T-amyZ、pET-29a、pET-29a-amyZ

1．1．2 培养基与试剂

TE缓冲液： 50mMTris-HCl 20mM EDTA pH8。0

EDTA盐缓冲液:0。15M NaCl 0。1M Na2-EDTA pH7。0 SDS 2。5％

CATB提取液：100mM Tris-HCl,pH8。0;1。4M NaCl;20mM EDTA;2％CTAB（W/V）

CTAB沉淀液：50mM Tris-HCl；pH8。0；10mM EDTA；1％CTAB（W/V）

LB培养基：蛋白胨10g/L; NaCl 10g/L;酵母提取物10g/L

卡那霉素、IPTG、考马斯亮蓝、甘油

DNS 试剂：5g3,5-二硝基水杨酸（DNS）于 800ml 水中，加入 16gNaOH，130g 酒石酸钾钠溶解后，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸搅拌溶解冷却后加水定容至 1L。

Ni2+-NTA柱填料(Qiagen,CA,USA)购自Invitrogen，其余各化学试剂均为分析纯。

1．1．3 PCR扩增使用的引物

amyZ-F1： GAATTCCATATGCGCCCCCTCCGCGGACTCTC(Nde I)

amyZ-R1： TCCGCTCGAGGCGCAGCCGCCAGATGCC ( Xho I)

1．2 表达载体pET-29a-amyZ的构建

1。2。1粘细菌DNA的提取

采用NaOH-CTAB法对粘细菌的总DNA进行提取[8]。 Corallococcussp.EGB来源的麦芽糖淀粉酶AmyZ的基因克隆表达及其酶学性质研究(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_102001.html