3.10 连接产物的转化    13
3.11 重组质粒的验证    14
3.11.1 重组质粒提取验证    14
3.11.2 重组质粒PCR验证    14
4． 实验结果    14
4.1 PCR扩增目的片段    14
4.2 蓝白斑筛选阳性菌质粒提取    15
4.3  TA克隆产物双酶切    16
4.4小片段割胶回收    17
4.5 重组质粒的提取    18
4.6 重组质粒的PCR验证    18
5. 结论    20
致 谢    21
参考文献    22
 1 绪论
1.1  亚硝酸盐简介
亚硝酸盐通常是一种白色粉末，有些为微带黄色结晶，易溶于水，因其常用于工业用途故俗称工业用盐，在食品加工过程中，尤其是肉类制品的生产加工，硝酸盐和亚硝酸盐，由于其能使得肉制品呈现良好的色泽（鲜红色)可作为发色剂，还具有抑制肉毒梭菌的生长并减少其毒素产生的作用可作为防腐剂使用，因此常常被用作食品添加剂。[1]亚硝酸盐在生活环境中广泛存在，包括食物、土壤和水等，是一种危害人体健康甚至威胁人类生命的物质，一定量的亚硝酸盐就有可能直接导致人体中毒，更严重的还可能致人殒命；亚硝胺是一种致癌物质，而亚硝酸盐正是这种物质的前体，成为潜在的致癌物质。[2]我国食品添剂卫生管理标准对亚硝酸盐添加量有明确规定,一般不可大于150ppm；制品中的残留量，以亚硝酸钠的含量作为计量标准,罐头中该物质含量不可超过50PPm；香肠、火腿肠等产品中该物质含量不可超过30PPm。

1.1.1 亚硝酸盐危害
在人体内，红细胞负责将氧运输到身体的各个组织器官中，血红蛋白是其完成功能的关键所在，这是因为血红蛋白中含有二价铁离子，可以与氧结合。但作为一种强氧化剂，亚硝酸盐会把二价铁转化为三价铁，因此细胞也就无法与氧结合，这是导致细胞缺氧而中毒的原因，也会成为铁血红朊症发生的原因。情况严重时有可能导致呼吸中枢麻痹，抑或是窒息而死亡；另外，亚硝酸盐还能造成流产及死胎。一些食品中含有次级胺，在人体内亚硝酸盐的关键前体会与该物质发生反应，生成一种致癌物质，即N-亚硝基化合物；这两种物质在酸性条件下可能会生成亚硝胺，亚硝胺是一种可以引发消化系统癌变的强致癌物，在胃腔中就可能会发生这种反应。[3][4]

1.1.2亚硝酸盐来源

（1）蔬菜来源
氮素是植物生长过程中的一种主要营养元素，缺少氮素会使植物呈现不良的生长状况，所以它对植物来说是必不可少的。在合适的用量内，对喜氮植物施用氮肥，可以使蔬菜产量得到显著的提高。但若是不加控制的使用或是乱用氮肥，会使蔬菜中含有过高的硝酸盐和亚硝酸盐，同时造成了环境污染。人体中八成以上的硝酸盐是由于食用蔬菜而摄入的，硝酸盐基本上不会直接危害人体健康，但生物作用会极易将体内的硝酸盐转化为亚硝酸盐。
如我们所知，泡菜这种食品自古以来就深受人们喜爱，它是一种利用乳酸发酵作用而制得的蔬菜产品，十分有益于人类的身体健康，具有很好的保健和医疗作用，例如降低胆固醇等，同时泡菜中乳酸菌活菌以及乳酸的含量很高，是以其能够对肠道中存在的腐败菌的生长起到十分明显的抑制作用并且使腐败菌的产毒作用减弱。并在综合利用蔬菜原料及蔬菜加工品种的开发起到积极作用。它是一种传统的大众食品。一直以来，自然发酵法是制作泡菜的传统方式，而这种方式存在着一定的不足之处，泡菜汁中反应底物含量少，发酵速率低，所用周期长，所得产品在口感上有所欠缺，且很容易受到环境因素的影响，不能得到质量稳定的产品。如上所述，蔬菜内富含硝酸盐，在人们吃下这种蔬菜并经过口腔内的细菌作用之后，硝酸盐将会被还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐是潜在的致癌物质，这也是致使泡菜产品不能获得稳定质量的原因。在泡菜的制作过程中，在有害微生物以及某些杂菌的作用下，原本蔬菜中含有的硝酸盐就会被转化为对人体有害的亚硝酸盐。[5] 植物乳杆菌中亚硝酸还原酶基因的克隆(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_11666.html