蛋白质的磷酸化与去磷酸化是生物体重普遍存在的一类重要的信号传导调节机制。通过这个过程细胞将多种胞外信号逐级放大并最终传递到细胞核内，调控一系列基因的转录，从而使生物体对外界环境的刺激做出应答。MAPK级联途径位于细胞信号传导网络的中心，参与调控细胞的生长分化新陈代谢、应答外界不良环境及病原物的侵染等多种生理过程。在对稻瘟病菌前期的研究中中，已经鉴定出同酵母FUS3/KSS1，SLT2和HOG1同源的PMK1，MPS1，OSM1 3个不同的MAPK通路[6,7]。在一些植物病原真菌中，已经对同稻瘟病菌MPS1同源的MAPK基因进行了功能分析。结果显示MAPK信号通路作为真菌致病性调节组分具有保守性。在酿酒酵母中，与细胞壁完整性(CWI)相关的MAPK信号途径是细胞对于胞内信号和外界环境条件刺激应答的重要调控手段之一[8,9,10]。CWI 信号通路的激活依赖于5个表面信号感知蛋白Wsc1，Wsc2，Wsc3，Mid2和Mtl1。在细胞受到外界的细胞壁压力刺激时，这些感受器与鸟苷酸交换因子Rom2相互作用，Rom2进而激活Rho家族的GTP酶Rho1并且将其重新释放回细胞膜上。Rho1激活蛋白激酶C(Pkc1)，后者磷酸化保守的MAP激酶串联体最上游的蛋白激酶Bck1(MAPKKK)。Bck1接着将信号传递给蛋白激酶Mkk1/Mkk2(MAPKK)，然后再传递给蛋白激酶Mpk1/Slt2(MAPK)。最后Mpk1/Slt2磷酸化转录因子Rlm1和SBF复合体(包括Swi4和Swi6)，来进一步调节细胞核中与细胞壁合成及重建和细胞周期相关的基因的表达[11] 。
本研究拟构建稻瘟病菌中自噬相关基因(ATG)和细胞壁完整性(CWI) 通路的组分的酵母双杂交载体，通过对细胞自噬相关基因与细胞壁完整性通路的组分MoMck1，MoMkk1，MoMps1的互作验证，寻找CWI通路参与调控自噬过程的切入点；为进一步研究CWI通路参与调控细胞自噬过程打开突破口，进而解释CWI途径参与调控细胞自噬的分子作用机制，研究结果为深入研究稻瘟病菌致病相关基因的功能，解析其致病机理提供理论基础。
1.1 材料
供试菌株稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)为野生型菌株Guy11。本实验研究采用的稻瘟病野生型菌株Guy11为稻瘟病菌分子生物学研究常用标准菌株，由本实验室保存。菌株的长期保存采用滤纸片保存方法。菌丝体在CM液体培养基中培养2 d，用于基因组DNA和总RNA的提取。酵母菌株AH109作为酵母双杂交的受体菌，克隆载体pGADT7和pGBKT7，pGBKT7-53&pGADT7-T和pGBKT7-Lam&pGADT7-T分别作为阳性和阴性对照。
1.2 方法
1.2.1 酵母双杂交载体的构建
酵母双杂交是检测蛋白之间相互作用的经典方法，经过多年的发展和完善，现在的双杂交系统已可以很好的避免假阳性，有效鉴定蛋白之间的互作。酵母转录因子GAL4包括两个分离但必须的结构域：位于N端的DNA结合域（DNA-BD）和位于C端的转录激活域（DNA-AD）。当DNA-BD和AD在空间上充分靠近时可启动下游基因的表达。将两个目标蛋白分别与DNA-BD和AD融合表达，若这两个蛋白互作，则会启动下游报告基因的表达。利用引物分别从稻瘟菌菌丝体中克隆MoMCK1，MoMKK1，MoMPS1的cDNA全长序列，PCR产物经相应的限制性酶切后克隆到酵母表达载体pGADT7上；同时克隆稻瘟病菌中的22个ATG基因的cDNA全长序列，PCR产物经对应的限制性酶切后克隆到酵母表达载体pGBKT7上。载体经测序验证正确后备用。
1.2.2 酵母双杂LacZ活性检测
采用乙酸锂转化法，将1.2.1中测序正确的pGADT7::MoMCK1、pGADT7::MoMKK1、pGADT7::MoMPS1与pGBKT7::ATGs质粒分别配对共转化AH109感受态细胞。将酵母菌株AH109在YPD培养基上划线培养，待长出单菌落后，挑取单菌落于4-5 mL含有Ade的YPD培养基中30℃培养12-24 h后，菌液转置100 mL YPD培养液中扩培约6 h。收集菌液，2000 rpm离心5 min，去上清。加入9 ml TE, 2000 rpm离心5min，去上清。加入5ml Lithim/Cesium Acetate Solution，30℃、65 rpm摇床轻摇30 min。2000 rpm离心5 min，去上清。加入500 µLTE，悬浮分装(100 µl/管)。将5µLCarrier DNA和5 µL Histamine Solution加入l00 µL感受态细胞中，混匀。分别加入待验证的载体5 µL，轻轻敲打后室温静置15 min。将0.8 mL PEG和0.2 mL TE/Cation Mixx充分混合后加入EP管中，充分混合。先30℃静置10 min，再42℃热击10 min，然后14000 rpm离心30 s去上层液体。加100 µL SOS悬浮菌落后涂布到SD平板上，30℃培养3d后进行验证。进一步对能在SD-His-Trp-Leu-Ura培养基上生长的转化子进行LacZ+活性分析。 稻瘟病菌细胞壁完整性通路蛋白参与细胞自噬的功能分析(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_19403.html