2。1。4。1 U9溶液（9 M尿素，2 % CHAPS，1 % DTT） 

    用电子天平称取2。70 g尿素，加入至盛有3 mL的HPLC H2O的烧杯中，加热使其充分溶解（注：加热温度不能超过37℃），再将称取好的0。1 g CHAPS加入溶液中，充分溶解后转移到容量瓶中，用HPLC H2O定容至4。5 mL，然后加入0。05 g DTT，定容至5 mL。将配制好的溶液各取100 µl装到500 µl的离心管中，并用封口膜封好放置-80℃冰箱中备用（注：不能反复冻融）。

2。1。4。2 WCX-2缓冲液 (50 mM NaAC，PH 4。0)   

    电子天平称取0。82 g无水乙酸钠，放入180 mL HPLC H2O中，搅拌使其充分溶解，滴加HCL调节溶液PH至4。0。将调节好PH的溶液用玻璃棒转移至200 mL容量瓶中，定容。放置4℃冰箱内备用。

2。1。4。3 1% TFA溶液 

    移液枪取10 µl TFA到离心管内，再加入990 µl的HPLC H2O，吹打混匀，盖上盖子密封，裹上锡纸放置于4℃环境中避光保存（注：有效期为5天）。

2。1。4。4 SPA饱和溶液 

    吸取80 µl ACN加入有80 µl 1% TFA溶液的离心管中混匀，后加到SPA分装管中，再放到旋涡混合器中进行充分混匀，时间约3 min。取出，室温下静置5 min，再放到离心机中10000 rpm离心5 min。吸取上清液到新的离心管中备用（注：此溶液应即配即用）。

2。1。4。5 CHCA基质溶液 

    电子天平称取CHCA 4 mg，加入盛有1 mL 60% ACN/0。1% TFA的离心管中，振荡使其充分溶解，后放到离心机中10000 g离心2 min，取上清液到新的离心管中备用。

2。1。5 主要仪器

生物安全柜购自美国Forma公司；超净工作台购自苏州净化设备有限公司；冷冻高速离心机2K15C购自美国Sigma-Aldrich公司；高压灭菌锅MLS-3750型购自日本SANYO公司；SELDI-TOF MS (model PBS II-c)购自美国Ciphergen Biosystems公司；Milli-Q纯净水系统购自德国Millipore公司； 电热恒温水浴槽购自江苏海门公司、常温高速离心机购自美国Eppendorf公司、恒温振荡器购自江苏太仓科教器材厂、电子天平购自上海精科天平厂、PH计购自瑞士METTLER TOLEDO公司。文献综述

2。2方法

2。2。1血清样品处理

  血清样品处理方法：将血清样品从-80℃中取出，置冰盒上融解以4000 g，4℃离心2 min。再取10 µl血清加20 µl U9溶液混合孵育30 min后，加入370 µl WCX-2缓冲液稀释（血清最终上样量为2。5 µl）。

2。2。2WCX磁珠处理血清

2。2。2。1WCX纳米磁珠活化

WCX磁珠处理血清可按说明书进行  取50 µl WCX纳米磁珠加入200 µl PCR管，放置磁性分离板上孵育1 min（注意避免由于孵育时间过长导致磁珠结块），后吸除上清液。在PCR管加入100 µl WCX-2缓冲液洗脱5 min，然后放置磁铁上孵育1 min，吸除上清液，此步骤进行2遍，保证磁珠的活化。再吸取100 µl经过处理的血清样品加入到PCR管中吸打混匀（注意避免产生气泡）。