实验方法与材料

一、实验方案

（一）质粒的提取

1。 细胞复苏 

（1）从-80℃取出细胞

（2）在37℃水浴中摇晃解冻（1min之内）

（3）1000rpm离心5min

（4）弃去上清，加入培养基，吹打数次

（5）加入已经放有预热了的培养基的培养皿内

2。挑单克隆培养

（1）取100ul菌液于试管中，在37℃下以250转/分钟振荡约2h

（2）将菌液转移至1。5ml离心管中冰浴冷却15min

（3）在4摄氏度下，以每分钟4000转离心15min

（4）用200ul 1mol/L的Cacl2重悬细胞，冰浴30min后以4℃，4000转/分钟离心15min并弃去上清

（5）加入1g质粒（本次实验中使用了Scribble、Lano、Syn-DIGI三种），冰上30min

（6）在42摄氏度水浴90s后，在冰上放置10min

（7）加入200ul培养基， 37℃下200转45min

（8）将转化了的细菌均匀涂抹在固体培养基上，37℃过夜

（9）取出固体培养基，在超净台上，挑选肉眼可见菌落，挑入液体培养基，180转/分钟过夜，抽取质粒

3。质粒的中提文献综述

质粒小提后经DNA凝胶电泳验证无误后进行中提制备

（1）细胞培养与收获：4500-6000g，4℃，15min（离心管内样品量在1/2至2/3）

（2）细胞溶解：8ml Buffer RES-EF 温和摇晃吹打5次，不要剧烈旋转

 8ml Buffer LYS-EF 在室温下静置5min，转移至50ml管

（3）平衡过滤柱与过滤器： 15ml Buffer EQU-EF（沿边缘加入），使之润湿

（4）中和：8ml Buffer NEU-EF，完全混合直到蓝色消失，冰上孵育5min

（5）澄清和装载溶菌产物：颠倒管子3次，加入第4步产物于过滤柱（可离心5000g，10min）

（6）第一次洗涤：5ml Buffer FIL-EF，使其自然滴下流空

（7）滤过迁移：丢弃过滤柱

（8）第二次洗涤：35ml Buffer ENDO-EF，使其流尽

（9）第三次洗涤，15ml Buffer WASH-EF，使其流尽

（10）洗脱：5ml BufferELU-EF，在15或50ml管中收集洗提物

（11）沉淀：3。5ml异丙醇 15000g，4℃，30min