③基因工程构建高产氨基葡萄糖工程菌

21世纪以来，生物科学界发展在前沿领域的莫过于基因工程、分子生物学技术，其独到的先进性和以先进的操作技术成功的为现代科学打开了一扇大门。能够利用此项技术在多个领域突破了研究的瓶颈。通过研究人员发现通过基因工程改造后的大肠杆菌，相比野生菌有明显的优势。通过对大肠杆菌产GlcN的代谢途径进行修改，即对酶的编码基因进行先进性过量表达，再对基因进行失活或敲除处理，使菌体可以产生更多的胞外氨基葡萄糖，而又可以缓解菌体被抑制生长的情况，能够有效提高GlcN的产量。虽然也有其他的表达系统，但是由于大肠杆菌结构简单易操作等优点，目前是得到运用最多的系统。

1.2.4氨基葡萄糖在微生物中的合成途径

本实验中是采用欧文杆菌来进行发酵生产氨基葡萄糖，由于欧文杆菌和大肠杆菌同属，故其产氨基葡萄糖途径与大肠杆菌中类似。在此以大肠杆菌做以说明。在大肠杆菌的代谢途径中，第一步是葡萄糖通过协助扩散进入到大肠杆菌细胞中。一般来说，物质通过膜运输是不需要进行化学修饰，但是有些糖在通过细菌的细胞膜膜时需要进行磷酸化，通过加入一个磷酸基团协助转运，以糖-磷酸的形式才能通过膜，称为基团运输。随后进入细胞的葡萄糖第一步是进行糖的磷酸化，在葡萄糖磷酸异构酶作用下转变为6-磷酸葡萄糖，简写为G-6-P。对于细菌和真菌来说，磷酸果糖激酶是十分重要的限速酶，可以通过调节此处的酶量或通过改变酶的结构来调节反应的快慢。代谢途径中，在氨基葡萄糖合酶作用下将G-6-P变为GlcN，但是产出过多的氨基葡萄糖会对菌体生长产生抑制，因此可以通过将氨基葡萄糖转变为N-乙酰氨基葡萄糖，这种情况就会改善很多[19]。在接下来的反应中氨基葡萄糖又会在氨基葡萄糖乙酰化酶的作用中，将GlcN转化为乙酰氨基葡萄糖，而乙酰氨基葡萄糖又会在菌体内的自然弱酸的环境下转变为氨基葡萄糖。

1.2.5氨基葡萄糖的提取

正如上文所述，氨基葡萄糖的制备主要有三种方式，通过甲壳素获得的氨基糖都会产生杂质和一些处理的副产物，得到不纯净的产物。需要复杂的过程和手段提取目的产物。所以若使用虾蟹壳制备GlcN时，提取产物时均需要分离、浓缩、结晶、烘干等化学方法处理。通过微生物所得GlcN时，由于发酵过程产物与大量的杂质形成混悬液而不容易直接提取，在提取之前一般会进行发酵液的预处理，发酵液是成分复杂的系统，其中包括菌体，未利用的培养基或者其他固体物质等。通过高速离心去除菌体和其他不融物质，或者可以使用滤纸等进行过滤。此时也要通过离心，过滤等机械方式将杂质分离开来。之后在上清液中在通过离子交换的方式来提取，将上清液持续的流过100℃的树脂，之后需要2N盐酸进行洗提过程。据估计，通常得到最终的氨基葡萄糖固体产品基本能达到85%的纯度[20]。提取的时候也要考虑到成本和是否会对生态环境造成严重的污染。