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小鼠Boule基因核心启动子区的鉴定与分析

哺乳动物的精子发生是一个复杂的过程，其中涉及有丝分裂、减数分裂和精子形成等三个主要阶段[1]，其中减数分裂是精子发生过程中的不可或缺的关键步骤。参与减数分裂的基因的缺失或突变均有可能引起精子发生产生异常，而DAZ家族就是其中十分重要的一类。目前的研究可知DAZ基因家族有3个成员，分别是DAZ、DAZL和Boule[2]基因，它们在生殖细胞中特异性的表达，DAZ基因家族的缺失或突变、表达水平的降低或缺乏均会影响动物的生殖发育。进一步的研究表明，Boule基因在精子发生的减数分裂过程和精子形成过程中发挥着重要的调控作用，此外，Boule基因表达的改变或Boule蛋白的缺乏与生精障碍、减数分裂阻滞等密切相关[3]，因此Boule基因是精子发生过程中的必需因子，其正常表达对于雄性精子发生而言是至关重要的。

Boule基因是1995年Eberhart等人在果蝇的研究中发现的与精子形成相关的基因[4]，研究人员发现它的基因结构与生物学功能与DAZ家族成员相似[5]，因此Boule基因被认为是DAZ家族的成员之一[3]。进一步的临床数据发现，在精子发生异常的患者中，其Boule基因表达相对减弱；在精子发生障碍的患者中，Boule基因的表达量与正常男性相比显著减少；在减数分裂滞阻的患者中Boule基因则不表达[6]。由此可见，Boule基因是否正常表

达，以及其表达量的高低对人类的精子发生有重要的影响。在其他物种中，也有许多有关Boule基因调控减精子发生数分裂过程的研究报道，例如，在雄性果蝇中，Boule基因的突变会使得雄性果蝇的精母细胞在G2/M期停止发育，从而导致了雄性果蝇的生精障碍[7]；有研究人员构建了Boule基因敲除小鼠，发现精子发生停滞在初级精母阶段[8]；除此之外，研究人员对雄性不育的犏牛进行研究，将正常的黄牛作为对照，发现犏牛睾丸组织中Boule基因mRNA表达量相较黄牛显著降低[9]。以上研究结果表明，参与精子发生的关键基因的表达受到影响会阻碍精子的正常发育，Boule基因的正常表达是生殖细胞正常发育不可或缺的。

综上所述，Boule基因在精子发生过程中有着至关重要的作用，其突变或表达缺失均会引起不同程度的精子发生障碍、减数分裂阻滞等问题，因此Boule基因是目前雄性生殖和雄性不育领域的研究热点。本研究首先对Boule基因5’调控区序列进行克隆与分析，进一步对转录因子结合位点和CpG岛进行预测；此外，鉴定其核心启动子区域，为以后研究Boule基因的生物学功能及表观遗传修饰对其表达的影响打下基础，对雄性生殖的临床治疗提供借鉴价值。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物和睾丸组织收集

本研究选取30日龄的雄性ICR小鼠（购于南京青龙山动物繁殖场）。利用颈椎脱臼法处死小鼠，之后立即采集睾丸组织并且存储于-80℃冰箱中，用于小鼠睾丸组织基因组DNA的提取。