将2管100 L含Trans 5α超感细胞在冰上分装成4管,各50 L;每管中对应加入100 L的酶连产物;冰上放置30 min;45 ℃水浴热激45 s;冰上放置2 min;加入500 L的LB液体培养基,37 ℃、150 r/min摇床培养1 h;在菌体浑浊管中取200 L于含氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板(Amp终浓度为50 mg/mL)上涂布,37 ℃倒置培养过夜。
1.5.6 质粒DNA的提取
挑取转化DH 5α后平板中的单菌(周围无卫星菌落的大菌落),采用质粒DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提取质粒DNA,提取完毕后使用琼脂糖凝胶电泳检测,检测质粒DNA的大小为1.5 kb左右。
1.5.7 测序与分析
TA克隆后的片段进行测序(由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)。将测得的序列用BLAST 软件与GenBank 数据库及EzBioCloud中已知的16S rDNA基因序列进行同源性的比较及分析,下载序列,使用用MEGA 7.0软件使用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树,确定菌株的分类地位。
1.6 降解菌S10的降解曲线
将菌株S10的培养液,以5 %的接种量,接种到10 mL含50 mg/L乳氟禾草灵的无机盐液体培养基中,30 ℃、160 r/min摇床中振荡培养,定时检测菌株对乳氟禾草灵的降解情况。以不接菌的50 mg/L乳氟禾草灵的无机盐液体培养基作为空白对照。
1.7 降解菌S10的降解特性研究
对分离到的乳氟禾草灵降解菌株S10的降解特性进行研究,主要测定不同影响因子(接种量、温度、初始PH值、乳氟禾草灵初始浓度、碳氮源等)的情况下菌株S10对乳氟禾草灵的降解效率的影响。
1.7.1 接种量对降解效率的影响
在装有3 mL的LB液体培养基的10 mL试管中加入乳氟禾草灵,使其终浓度为50 mg/L,分别以1 %、2.5 %、3.5 %、5 %、7.5 %的接种量接入菌株S10, 30 ℃,160 r/min摇床振荡培养。7 d后HPLC检测乳氟禾草灵的含量。 除草剂乳氟禾草灵降解菌株S10的分离鉴定及其降解特性研究(4):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_20867.html