用打孔器制作直径6mm的圆形滤纸片，121℃20min灭菌备用，在制好的不同菌株的带菌培养基平皿内，用灭过菌的镊子分别放上浸有不同浓度的聚赖氨酸溶液的圆滤纸片，每个浓度做三个平行。而后将平皿放入恒温箱中，于37℃培养18h，霉菌28℃培养48h后，观察圆滤纸片周围抑菌圈的有无及大小，由于滤纸圆片所吸附的药剂缓慢向四周扩散，因此在滤纸片的周围出现抑菌圈，用游标卡尺精密测量出抑菌圈直径，记录结果并计算同一浓度聚赖氨酸抑菌圈直径的平均值，抑菌圈直径的大小就代表聚赖氨酸抑菌能力的高低。
2.2.5 MIC的确定
(1) 液体培养法（大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌）
分别在每个试管加入5mL培养基[20]，一组作为空白对照（不加菌悬液），一组为无添加聚赖氨酸(ε-PL)（加菌悬液），其余试管分别加入不同浓度的聚赖氨酸(ε-PL)0.5mL，以及0.1mL菌悬液，37℃摇床培养24h，观察之后分别涂布平板于37℃培养箱培养24h，计算菌落数，算出抑菌率，每组三个平行，取其平均值。

(2) 菌体湿重法（黑曲霉）
分别在每个试管加入5mL培养基，一组作为空白对照（不加菌悬液），一组为无添加聚赖氨酸(ε-PL)（加菌悬液），其余试管分别加入不同浓度的聚赖氨酸(ε-PL)0.5mL，以及0.1mL菌悬液，28℃摇床培养48h， 3000r/min离心10 min后去上清液，称湿重计算出抑菌率，每组三个平行，取其平均值。
2.2.6供试化妆品的制备
表2.4.雪花膏配方[21](质量百分比)
　    成分商品名称    比例    功效
A相    羊毛脂    2    油脂/助乳化剂
    18#白油    6    油脂
    杏仁油    3    油脂/润肤剂
    十优尔、十八醇    1    增稠乳剂
B相    Cutina GMS    0.5    乳化剂
    Tween-80    1    乳化剂
    Tween-60    3    乳化剂
    甘油    10    保湿剂
    D-W    61    
将组分A混合加热至85℃，将除防腐剂外其他B组分混合加热至85℃。将A组分加于B组分进行乳化反应（不断搅拌），当温度降至52℃时分装为两组，一组加入适量防腐剂，一组不加。分散均匀后，停止搅拌，即为成品。
2.2.7防腐剂效力测试
分别称量10 g添加了不同品种和含量防腐剂的化妆品样品于无菌瓶中, 每瓶中分别加入每种菌悬液0.2 ml, 充分震荡混匀后, 于室温（25℃）存放。于6h、24h、48h、72h、5d、7d时，取1g样品均匀涂布于卵磷脂-吐温-营养琼脂，按平板计数法检测微生物的生长情况。按照菌的减少率评价防腐剂效力[22]，抑菌率计算公式如下：
抑菌率%=对照组菌落总数 / 添加防腐剂菌落总数（相同时间内）×100%
3 实验结果与分析
3.1防腐剂抑菌效果实验观察结果
3.1.1 防腐剂对大肠杆菌的抑菌效果
表3.1不同防腐剂对大肠杆菌的抑菌效果（滤纸片法）

浓度(mg/L)     抑菌圈直径（mm）            
    聚赖氨酸    尼泊金甲酯
200    _    9.00（±1.87）
500    _    8.17（±0.62）
800    _    11.33（±0.94） 聚赖氨酸作为化妆品防腐剂可行性分析(6):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_2640.html